基因工程改造植物乳桿菌生產光學純D-乳酸

張媛 王小艷 陳博 李義 佟毅

摘 ?????要： 為獲得高產高光學純D-乳酸生產菌，本研究從篩選得到的一株耐高溫耐高糖的植物乳桿菌出發，利用基因工程技術，敲除其中與L-乳酸合成相關的基因，引入或增強D-乳酸脫氫酶活性，構建了一株基因工程菌Lp-DA。該菌株可45℃發酵，產乳酸近200 g/L，D-乳酸光學純度達到99.9%，為光學純D-乳酸工業生產提供了新的菌株選擇。

關 ?鍵 ?詞：D-乳酸;植物乳桿菌;光學純;基因敲除;基因敲入

中圖分類號：TQ 78 ??????文獻標識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2019）04-0674-06

Abstract： ?In order to obtain high-yield and high-optical pure D-lactic acid producing strain， a strain of Lactobacillus plantarum with high temperature and sugar tolerance was screened out. Starting from this strain， a genetically engineered strain Lp-DA was constructed by knocking out the genes related to L-lactic acid synthesis and introducing or enhancing the activity of D-lactic acid dehydrogenase. This strain can be fermented at 45 ℃ to produce nearly 200 g/L of lactic acid， and the optical purity of D-lactic acid can reach 99.9%. It provides a new strain option for industrial production of optical pure D-lactic acid

Key words： ?D-lactic acid; Lactobacillus plantarum; optical pure; gene knockout; gene knockin

聚乳酸（Poly-lactic acid，PLA）是一種以乳酸為主要原料聚合得到的聚合物，利用生物質資源作為原料，來源豐富而且可再生。聚乳酸的生產過程無污染，其產品可以生物降解，實現在自然界中的循環，與有限的石油和化石資源相比，生物質資源的優勢在于不會有釋放到大氣中的凈二氧化碳[1]，因此是理想的綠色高分子材料，具有廣闊的市場前景。近年來聚乳酸技術的突破提高了其力學、耐熱、耐久性能及生物相容性，促進了聚乳酸在高性能、高附加值材料領域的應用拓展[2]。國內外許多研究表明聚L-乳酸和聚D-乳酸的共聚可提高其機械性能、熱穩定性等，實現聚乳酸材料的改性[3，4]，拓寬了聚乳酸的應用范圍。

乳酸（Lactic acid）又叫α-羥基丙酸、丙醇酸，根據其結構中的手性碳原子劃分為L-乳酸和D-乳酸。聚乳酸的合成需使用高光學純度的乳酸單體作為前體。高光學純度的D-乳酸，因其可被用來提高聚乳酸材料的性能而備受關注。利用發酵法生產乳酸具有生產成本低、產物光學純度和安全性高、生產條件溫和、污染小等優點。然而，大多數乳酸菌只能同時生產L-乳酸和D-乳酸，只有極少數的天然乳酸菌和一些模式工程菌可用于專門生產D-乳酸，這些菌株D-乳酸產量和光學純度仍需要進行大幅度的提升，因此，在通過微生物發酵法大規模工業生產D-乳酸時，目前可選擇的菌株仍然十分有限。由此，高產高光學純度D-乳酸的發酵菌株成為該領域的研究熱點。

本研究從大曲樣品中篩選獲得耐高溫高糖的乳酸菌，并利用基因工程技術，敲除其中與L-乳酸合成相關的基因，并引入或增強D-乳酸脫氫酶的活性，構建一株高產高光學純度的D-乳酸工程菌，達到提高D-乳酸產量和光學純度的目的。為光學純D-乳酸工業生產發酵菌株提供了新的選擇。

1 ?實驗部分

1.1 ?實驗材料

1.1.1 ?菌株及培養條件

大腸桿菌DH5α菌株為購于全式金公司的Trans5α感受態，培養使用LB培養基，37 ℃培養，篩選用抗生素濃度為25 μg/mL 氯霉素或250 μg/mL紅霉素。

植物乳桿菌Lp43#篩選自大曲樣品，培養使用MRS培養基。37～45 ℃培養，篩選用抗生素濃度為10 μg/mL 氯霉素或10 μg/mL紅霉素。

1.1.2 ?酶和試劑

EasyTaq Mix，DNA Assembly Mix，DNA marker，凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒等購于全式金公司;PrimeStar DNA聚合酶購于TaKaRa公司;基因組提取試劑盒購于TIANGEN公司;限制性內切么、DNA連接酶購于NEB公司;紅霉素、氯霉素等購于Solarbio公司。

1.1.3 ?培養基

LB培養基：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.0。

MRS液體培養基：蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、檸檬酸二銨2.0 g/L、無水乙酸鈉5.0 g/L、硫酸錳0.25 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、吐溫80 1.0 mL/L，pH 6.5;MRS固體培養基：在上述MRS液體培養基中添加瓊脂20 g/L;MRS-CaCO3平板：MRS固體培養基中再加入CaCO3 10 g/L;發酵培養基：葡萄糖180～200 g/L、酵母提取物10 g/L、乙酸鈉2 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、MnSO4·H2O 0.25 g/L、吐溫80 1 ml/L、CaCO3 90～100 g/L，pH 6.5。

1.2 ?實驗方法

1.2.1 ?菌株的分離篩選

將1 g大曲樣品搗碎后用10 mL無菌生理鹽水溶解，充分混勻30 min;取上述稀釋液10倍梯度稀釋后涂布于MRS-CaCO3平板，37 ℃培養24 h，挑取透明圈較大的菌落接種MRS培養基，37 ℃ 150 r/min培養1 h，取5 μL培養液點在MRS-CaCO3平板上，將平板放置于45 ℃培養箱中培養40 h;挑選平板中菌落生長較快并且溶鈣圈較大的幾個單菌落再次轉接MRS培養基，37 ℃ 150 r/min培養1 h，取5 μL培養液點在MRS-CaCO3固體平板上，將平板放置于48 ℃培養箱中培養。挑選其中溶鈣圈比較明顯的備選菌株保存并進行發酵搖瓶實驗。

將備選菌株接種MRS培養基，37 ℃ 150 r/min過夜培養獲得種子液，在30 mL發酵培養基中按照10%（v/v）的比例接種上述種子液，37 ℃ 150 r/min搖床培養3～5 h讓菌株生長，然后升溫到45 ℃或48℃，繼續以150 r/min搖床培養72 h獲得發酵液。發酵結束后通過高效液相色譜檢測發酵產物中的乳酸，篩選出高溫高糖條件下產乳酸較快、乳酸產量較高的菌株。

1.2.2 ?菌株鑒定

篩選獲得的菌株通過顯微鏡檢測菌株形態，并結合16S rDNA 測序方法，鑒定菌株分類。

1.2.3 ?重組質粒構建

基因敲除質粒構建：使用對應引物（表1）分別擴增大腸桿菌復制子p15Aori（來自商業載體pACYC）、紅霉素抗性基因EmR（來自商業載體pMG36e）、待敲除基因CDS上游1 000 bp序列（擴增自Lp43#基因組）、氯霉素啟動子P32、氯霉素抗性基因CmR（來自商業載體pNZ8148）和待敲除基因CDS下游 1000 bp序列（擴增自Lp43#基因組），使用DNA Assembly重組試劑盒組裝成為基因敲除質粒，轉入Trans5α感受態，氯霉素和紅霉素抗性，經測序鑒定，獲得pKO-GeneX系列質粒，GeneX為ldhL1、ldhL2或larA（圖1）。

基因插入質粒構建：分別合成待插入基因植物乳桿菌的ldhD（Gene ID：1061762）和德氏乳桿菌ldhA（Gene ID：4085369）基因的CDS序列，并在起始密碼子之前和終止密碼子之后分別加入XhoI和BamHI酶切位點，雙酶切獲得待插入基因的片段;將前面構建的pKO質粒同樣用XhoI和BamHI雙酶切獲得去除了氯霉素抗性基因的載體片段，將經過同樣雙酶切并純化后的載體和基因片段用DNA連接酶連接后，轉入Trans5α感受態，紅霉素抗性，經測序鑒定，獲得基因插入質粒，命名為pKI-X：GeneY，GeneY為ldhD或ldhA（圖2）。

1.2.4 ?植物乳桿菌電轉化

接種平板活化的植物乳桿菌單菌落于4 mL MRS培養基中37 ℃ 150 r/min過夜培養，按初始OD600= 0.2轉接至100 mL含1%甘氨酸的MRS培養基中，37℃搖床培養至OD600= 0.6;菌液冰浴20 min，4 ℃、8 000×g離心15 min收集菌體;用100 mL 4℃預冷的1 mM MgCl2和30% PEG1000依次沖洗菌體1次;用1 mL 4 ℃預冷的30% PEG1000重懸菌體，每份分裝100 μL感受態。

每份感受態細胞加入5 μg重組質粒，冰浴10 min，使用0.2 cm電轉杯，1.5 kV、25 F、200 Ω電擊，迅速加入0.8 mL MRS-SM培養基（在MRS培養基中加入0.5 M蔗糖和0.1 M MgCl2），37 ℃培養2 h，離心1 min，去掉部分上清后重懸涂布于含抗生素的MRS平板上，37 ℃培養2 d獲得單菌落。

1.2.5 ?基因敲除菌株篩選

植物乳桿菌中電轉化導入基因敲除質粒，氯霉素抗性篩選，并使用對應鑒定引物菌落PCR，獲得有2條條帶的發生了第一次交換的陽性轉化子，挑選1～2個陽性轉化子用含氯霉素的MRS液體培養基傳代培養，每2代劃線并菌落PCR篩選僅剩較小一條條帶，即為第二次交換成功的菌株，經測序確認目標基因已敲除，即獲得目標基因敲除的植物乳桿菌菌株。

1.2.6 ?基因插入菌株篩選

在植物乳桿菌敲除菌株中轉入對應的基因插入質粒，紅霉素抗性篩選，并使用對應鑒定引物菌落PCR，獲得有2條條帶的發生了第一次交換的陽性轉化子，挑選1～2個陽性轉化子用無抗MRS液體培養基傳代培養用于篩選第二次交換的菌株，成功發生基因插入的菌株菌落PCR結果應僅剩一條偏大條帶，經測序確認目標基因已插入到基因組中對應位置，即獲得目標基因敲入的植物乳桿菌菌株。

1.2.7 ?發酵方法

將菌株接種20 mL MRS培養基，37 ℃ 150 r/min過夜培養獲得種子液。然后，在100 mL產酸發酵培養基中按照10%（v/v）的比例接種上述種子液，37 ℃ 150 r/min培養6 h讓菌株生長，然后維持37 ℃或升溫至45 ℃，繼續以150 r/min轉速培養66 h獲得發酵液，發酵過程中定期取樣檢測發酵產物。

1.2.8 ?產物分析

乳酸、葡萄糖等濃度檢測方法：色譜儀為Agilent Technologies 1260 Infinity II;檢出器RID;分離柱為Aminex HPX-87H Column 300 mm×7.8 mm;流動相0.005 M硫酸;流量0.5 mL/min;進樣量20 μL。

乳酸的光學純度檢測方法：色譜儀為Agilent Technologies 1260 Infinity;檢出器波長254 nm，靈敏度0.32AUFS;分離柱為MCI GEL-CRS10 W（3u）4.6 ID×50 mm;流動相0.002 M硫酸銅;流量0.5 mL/min;進樣量20 μL。根據峰面積計算L-乳酸和D-乳酸的比例。

增強乳酸發酵菌株對環境脅迫的抵抗力是提高乳酸發酵能力的方向之一，本研究通過篩選，獲得了耐高溫、高糖的乳酸發酵菌株。利用耐高溫菌株進行發酵可以縮短生產周期、減少溫控所需的能耗以及減少雜菌污染的風險;而耐高糖的性能有助于簡化發酵工藝，提高乳酸總產量。

采用基因工程手段對乳酸高產菌株進行改造，能進一步提高其產酸效率和乳酸的光學純度。本研究使用同源重組的基因工程手段，敲除了植物乳桿菌中可能與L-乳酸合成相關的基因，并在同一位點替換了外源或內源的D-乳酸脫氫酶基因，進一步提高其活性。發酵結果分析認為，敲除菌株ldhL1、ldhL2、larA基因后，阻斷了代謝途徑中可能的L-乳酸代謝，同時，菌株的乳酸積累不受這幾個基因缺失的影響，表明該植物乳桿菌的乳酸代謝過程中，乳酸脫氫酶的種類不是乳酸產量的限制因素。并且增加的D-乳酸脫氫酶活性更有助于提高D-乳酸的合成能力。改造后菌株與野生菌株相比，在乳酸產量和乳酸光學純度方面均有大幅提升。

同源重組方法是基因組改造的常用手段，產生的變化僅存在于基因組中，因此構建的突變體具有較高的遺傳穩定性。并且最終的菌株沒有選擇標記和質粒殘留，可避免常規基因工程菌培養體系復雜等問題，安全性較高，也便于對菌株進行進一步的代謝途徑改造。

最終獲得的菌株Lp-DA可在45 ℃條件下發酵大量生產乳酸，并且僅合成D-乳酸，該重組D-乳酸生產植物乳桿菌提供了滿足光學純D-乳酸工業生產的新選擇。當然，新菌株的工業應用還需要與菌株特性相適應的高效發酵工藝和低能耗的提取精制工藝，才能讓D-乳酸的發酵生產更具競爭力。

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