全蝎白術白頭翁組合發酵品不同醇濃度提取物的活性成分分析 及體外藥理研究

劉金虎 趙翠燕 孫志藝 王宇 陳宏飛 方園

摘 ?????要： 評價全蝎白術白頭翁組合發酵品（SAPZFP）不同醇濃度提取物的活性成分含量及體外抗腫瘤活性差異。分別測定SAPZFP不同醇濃度提取物的醇溶性總蛋白、總多糖、總黃酮的含量，并采用MTT法檢測不同醇濃度提取物抑制腫瘤細胞體外增殖的能力。SAPZFP不同醇濃度提取物均具有體外抗腫瘤活性，其中75%醇提物抑制乳腺癌細胞株MCF-7、肺腺癌細胞株A549體外增殖的能力最強，IC50分別為0.066、0.022 mg·mL-1。綜上所述，SAPZFP的25%、50%、75%醇提物均具有體外抗腫瘤活性，且75%醇提物效果最優。

關 ?鍵 ?詞：SAPZFP;雙向固體發酵;醇溶性活性成分;A549;MCF-7;抗腫瘤

中圖分類號：R285.5 ??????文獻標識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2019）06-1170-04

Abstract： To evaluate the differences in the content of active constituents and anti-tumor activity in vitro of SAPZFPs different alcohol concentration extracts， the contents of alcohol-soluble total protein， total polysaccharide and total flavonoids in SAPZFPs different alcohol concentration extracts were determined， and MTT assay was used to detect the inhibitory effect of different alcohol concentration extracts on the proliferation of cancer cells in vitro. SAPZFPs different alcohol concentration extracts all showed anti-tumor activity in vitro， 75% alcohol concentration extract had the strongest inhibitory effect on the proliferation of mammary cancer cells strain MCF-7 and lung adenocarcinoma cells strain A549 in vitro. In summary， the 25%， 50% and 75% alcohol extracts of SAPZFP had anti-tumor activity in vitro， and the 75% alcohol extract had the best effect.

Key words： SAPZFP; Bidirectional solid fermentation; Alcohol-soluble active constituents; A549; MCF-7; Anti-tumor

球孢白僵菌（B.bassiana）是叢梗孢科（Moniliaceae）白僵菌屬（Beauveria spp.）的絲狀真菌，現代研究表明，該菌的次生代謝產物具有誘導細胞程序性死亡以及抗腫瘤的作用[1]。我國名貴的傳統中藥白僵蠶，便是家蠶幼蟲經白僵菌感染僵化致死而得到的干燥全蟲，具有極高的藥用價值。隨著微生物發酵技術的進步，真菌藥物得到發展，中藥一類新藥槐耳菌質與槐耳沖劑便是藥用真菌固體發酵工程的代表產物[2]。本課題組根據雙向固體發酵技術，以全蝎、白術、白頭翁三味中藥作為藥性基質，以球孢白僵菌作為發酵菌株，制備全蝎白術白頭翁組合發酵品（SAPZFP）。前期研究表明，SAPZFP超聲水提液與未發酵品超聲水提液相比，具有更顯著的體外抗腫瘤活性。對于成分復雜的中藥來說，不同溶劑提取液的物質基礎、藥理活性與藥物安全性有很大差別[3]。故本實驗通過醇溶性總蛋白、總多糖、總黃酮的含量測定及MTT法檢驗細胞增殖的實驗，對SAPZFP不同醇濃度提取物的活性成分含量及體外抗腫瘤活性進行比較，確定更具藥理活性的SAPZFP提取方法，為后續研究奠定基礎。

1 ?實驗部分

1.1 ?儀器

FA1204B型電子天平（上海天美天平儀器有限公司）;PHS-25型pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）;SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）;KQ-500GVDV型雙頻恒溫數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;LGJ-18型冷凍干燥機（北京四環科學儀器廠有限公司）;ST16R型高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技有限公司）;UV9100B型紫外可見分光光度計（北京萊伯泰科儀器有限公司）;YRE-201D型旋轉蒸發器（鞏義市予華儀器有限責任公司）;HERACELL 150i型CO2培養箱（賽默飛世爾科技有限公司）;生物安全柜（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）;CKX41型奧林巴斯顯微鏡（Made in Philippines）;DNM-9602型酶標分析儀（北京普朗新技術有限公司）等。

1.2 ?試劑

蘆丁標準品（成都曼斯特生物技術有限公司）;牛血清蛋白（上海伯奧生物科技有限公司）;PBS（1×）pH7.2（SparkJade）;RPMI Medium 1640培養基（gibco）;胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）;胰酶細胞消化液（酚紅，biosharp）;MTT（BioFROXX賽國生物科技）;福林酚（上海源葉生物科技有限公司）;二甲基亞砜，無水葡萄糖，亞硝酸鈉，六水氯化鋁，氫氧化鈉，苯酚，硫酸，硫酸銅，酒石酸鉀鈉等均為國產分析純。

1.3 ?藥材與細胞株

全蝎購自山東省臨沂市，經山東中醫藥大學生藥系李峰教授鑒定為鉗蝎科動物東亞鉗蝎（Buthus martensii Karsch）;白術為菊科植物白術（Atractylodes macrocephala Koidz）的干燥根莖、白頭翁為毛茛科植物白頭翁（Pulsatilla chinensis （Bge.） Regel）的干燥根，均購自河北省安國東方藥城，經山東中醫藥大學生藥系李峰教授鑒定符合《中華人民共和國藥典》（2015年版）要求;球孢白僵菌桃5活化菌種（Beauveria bassiana （Bals.） Vuill）由山東省農業科學院植物保護研究所提供;乳腺癌細胞株MCF-7及肺腺癌細胞株A549均由山東省立醫院提供。

2 ?實驗方法

2.1 ?SAPZFP的制備

精密稱定經鈷 - 60滅菌的全蝎凍干粉[4]、白術粗粉、白頭翁粗粉各10.00 g，加入用無菌水稀釋至1×108個孢子·mL-1的二代球孢白僵菌桃5活化菌種（Beauveria bassiana （Bals.） Vuill）的孢子懸液，攪拌均勻，使濕度適宜，于光照自然、溫度25 ℃、濕度大于95%的條件下，約培養7 d，待菌絲長滿后適時取出，冷凍干燥即得SAPZFP，并低溫密封保存。

2.2 ?SAPZFP不同醇濃度提取物的制備

2.2.1 ?SAPZFP不同醇濃度提取液的制備

取“2.1”項中SAPZFP約0.5 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入體積分數為25%的乙醇溶液20 mL，調節pH值為9，于頻率80 kHz、輸入功率500 W的條件下，40 ℃恒溫超聲提取50 min后，在4 000 r·min-1、4 ℃條件下離心15 min，將上清液用中速濾紙抽濾后，重復提取一次，兩次濾液合并，用蒸餾水定容至100 mL，即得SAPZFP的25%醇提液（每個條件做2個平行樣）。SAPZFP的50%及75%醇提液同法制備。

2.2.2 ?SAPZFP不同醇濃度提取物凍干粉的制備

按“2.2.1”項中方法制備SAPZFP的25%、50%、75%醇提液，于40 ℃恒溫旋蒸至無醇味，經-18 ℃低溫凍結后，置于-60℃冷阱中預凍4 h。將預凍好的各醇提液置于冷阱腔上方凍干架，在真空度<10 Pa，冷阱溫度-60 ℃的條件下，真空干燥至物料溫度與室溫相同，即得SAPZFP的25%、50%、75%醇提物凍干粉。

2.3 ?SAPZFP不同醇濃度提取液的含量測定

2.3.1 ?醇溶性總蛋白的含量測定

采用Lowry法[5]進行SAPZFP不同醇濃度提取液醇溶性總蛋白的含量測定，以吸光度A1為縱坐標、牛血清蛋白質量濃度C1（mg·mL-1）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為A1=2.502 4C1+0.009 7（R2=0.998 4），質量濃度在0～0.2 mg·mL-1范圍內呈現良好線性關系。分別取“2.2.1”項中SAPZFP不同醇濃度提取液1 mL，置10 mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度線，得SAPZFP不同醇濃度提取液的供試品溶液，精密量取1 mL，進行測定，根據標準曲線方程計算出醇溶性總蛋白的含量，各醇濃度提取液的供試品溶液平行測定3次。

2.3.2 ?醇溶性總多糖的含量測定

采用苯酚 - 硫酸法[6]進行SAPZFP不同醇濃度提取液醇溶性總多糖的含量測定，以吸光度A2為縱坐標、葡萄糖質量濃度C2（mg·mL -1）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為A2=15.149C2+0.004 7（R2=0.999 1），質量濃度在0～0.05 mg·mL-1范圍內呈現良好線性關系。分別取“2.2.1”項中SAPZFP不同醇濃度提取液3 mL，置50 mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度線，得SAPZFP不同醇濃度提取液的供試品溶液，精密量取2 mL，進行測定，根據標準曲線方程計算出醇溶性總多糖的含量，各醇濃度提取液的供試品溶液平行測定3次。

2.3.3 ?醇溶性總黃酮的含量測定

采用NaNO2-AlCl3-NaOH比色法[7]進行SAPZFP不同醇濃度提取液醇溶性總黃酮的含量測定，以吸光度A3為縱坐標、蘆丁質量濃度C3 （mg·mL -1）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為A3=5.505 3C3-0.000 6（R2=0.999 6），質量濃度在0～0.2 mg·mL-1范圍內呈現良好線性關系。分別取“2.2.1”項中SAPZFP不同醇濃度提取液3 mL，置25 mL具塞試管中，補加體積分數為30%的乙醇溶液至5 mL，進行測定，根據標準曲線方程計算出醇溶性總黃酮的含量，各醇濃度提取液的供試品溶液平行測定3次。

2.4 ?不同醇濃度提取物凍干粉的體外抗腫瘤研究

2.4.1 ?腫瘤細胞的復蘇與培養

將凍存在-80 ℃超低溫冰箱中的乳腺癌細胞株MCF-7、肺腺癌細胞株A549快速融化，并用常規方法復蘇。乳腺癌細胞株MCF-7、肺腺癌細胞株A549均加入含有10%胎牛血清的RPMI Medium 1640培養基，置于37 ℃、5%CO2的條件下靜置培養。適時觀察細胞狀態和培養基的變化情況，及時換液，待培養瓶中細胞融合度達到80%～90%時，用胰蛋白酶消化法，按1：2的比例進行傳代。

2.4.2 ?不同醇濃度提取物凍干粉溶液的配制

取“2.2.2”項中SAPZFP不同醇濃度提取物凍干粉各約10 mg，精密稱定，用無血清RPMI Medium 1640培養基配成2 mg·mL-1的初始藥物濃度，在超凈工作臺中，用0.22 μm的針式無菌過濾器濾過后，依次用無血清RPMI Medium 1640培養基2倍稀釋，得1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg·mL-1的SAPZFP不同醇濃度提取物凍干粉溶液，用于下述體外抗腫瘤研究。

2.4.3 ?MTT法檢測不同醇濃度提取物抑制腫瘤細胞體外增殖的能力

取對數生長期的乳腺癌細胞株MCF-7，用常規方法進行消化，加入無血清RPMI Medium 1640培養基，制成密度為1×105個細胞·mL-1的單細胞懸液，每孔100 μL接種于96孔細胞培養板（每個板預留5個調零孔）。于37℃、5%CO2的條件下靜置培養，使細胞貼壁生長，24 h后，棄去上清液，加藥組每孔加入“2.4.2”項中不同醇濃度提取物凍干粉配制的不同濃度藥物溶液100 μL（每個濃度設置5個復孔），同時配制陰性對照組、100 μg·mL-1的順鉑陽性對照組。繼續常規培養24 h后，每孔在避光條件下加入MTT溶液（5 mg·mL-1）20 μL，繼續培養4 h后，棄去上清液，每孔加入100 μL的DMSO溶液，37 ℃恒溫震蕩混勻后，選擇492 nm波長進行比色，根據各孔的吸光度（OD）值，按下式計算細胞增殖抑制率。

抑制率（%）=[1-（加藥組OD值 - 調零組OD值）/（陰性對照組OD值 - 調零組OD值）]×100%

同法檢測藥物抑制肺腺癌細胞株A549體外增殖的能力。

2.5 ?數據處理

所有數據均采用Microsoft Excel （Office 2010）整合，并通過SPSS 17.0中Logit模型計算IC50。

3 ?結 果

3.1 ?SAPZFP不同醇濃度提取物的活性成分分析

SAPZFP不同醇濃度提取物的活性成分含量見表1。在試驗濃度范圍內，SAPZFP的25%醇提物的各活性成分含量最高，隨著乙醇濃度的增加，醇溶性總蛋白、醇溶性總多糖、醇溶性總黃酮的含量依次降低。

3.2 ?SAPZFP不同醇濃度提取物的體外抗腫瘤研究

3.2.1 ?SAPZFP不同醇濃度提取物對乳腺癌細胞株MCF-7的抑制作用

SAPZFP不同醇濃度提取物對乳腺癌細胞株MCF-7的抑制作用見表2。

在各試驗藥物濃度下，SAPZFP不同醇濃度提取物均對乳腺癌細胞株MCF-7有抑制作用，SAPZFP的25%醇提物、50%醇提物、75%醇提物對乳腺癌細胞株MCF-7的IC50分別為0.183、0.092、0.066 mg·mL-1。

3.2.2 ?SAPZFP不同醇濃度提取物對肺腺癌細胞株A549的抑制作用（表3）

在各試驗藥物濃度下，SAPZFP不同醇濃度提取物均對肺腺癌細胞株A549有抑制作用，SAPZFP的25%醇提物、50%醇提物、75%醇提物對肺腺癌細胞株A549的IC50分別為0.042、0.040、0.022 mg·mL-1。

4 ?結 論

利用藥用真菌的分解轉化能力對中藥及其復方進行發酵炮制，可以增強藥效，增加安全性，擴大適應癥。藥用真菌雙向固體發酵是以具有活性成分的中藥及其復方作為藥性基質，以藥用真菌作為發酵菌株的現代固體發酵[2]。一方面，藥性基質能提供藥用真菌生長所需要的營養物質，同時，藥用真菌的生長代謝過程也可以產生極具生理活性的次生代謝產物以及幾十種胞外酶，這種強大的酶系能對藥性基質的細胞進行破壁，加速有效成分的溶出，并能夠對藥性基質進行結構修飾和生物轉化，進而形成新的活性成分或改變各組分間的相互比例;另一方面，藥用真菌作為傳統中藥的一部分，療效確切，安全性較高，通過發酵有可能將藥性基質中的有毒成分分解轉化，從而在一定程度上增加中藥及其復方的安全性[8]。

本文研究表明：SAPZFP不同醇濃度提取物中，25%醇提物的醇溶性總蛋白、總多糖、總黃酮的含量最高;在體外抗腫瘤研究中，75%醇提物抑制乳腺癌細胞株MCF-7、肺腺癌細胞株A549的體外增殖能力最強，其IC50分別為0.066、0.022 mg·mL-1。由此可見，SAPZFP不同方法提取物的有效成分與藥理活性均存在差異，其中75%醇提物具有更好的體外抗腫瘤活性，本實驗結果為后續深入研究奠定了基礎。

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