正交實驗法優化地龍粉混合酶酶解工藝

呂迎蘭 田玉婷 毛會秀 劉金虎 陶然 方園 畢建云 王集會

摘 ?????要：探索了地龍粉混合酶（彈性蛋白酶和胰蛋白酶）酶解最佳工藝。在單因素實驗基礎上，采取正交實驗對地龍粉進行酶解。以酶解時間、酶解溫度、pH、加酶量為自變量，以地龍粉水解度為因變量，采用L9（43）正交實驗表進行實驗。各因素對實驗結果影響順序為：C>B>D>A。最佳酶解工藝條件為酶解時間8 h，酶解溫度55 ℃，pH=8，加酶量3 000 U，水解度達52.96%。

關 ?鍵 ?詞：地龍粉;正交實驗;彈性蛋白酶;胰蛋白酶;水解度

中圖分類號：O657.3 ??????文獻標識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2019）06-1174-04

Abstract： In order to explore the optimum enzymatic hydrolysis process of earthworm powder mixed enzymes （elastase and trypsin），on the basis of single factor experiment， the enzymatic hydrolysis of earthworm powder was carried out by orthogonal experiment. Taking enzymolysis time，enzymolysis temperature，pH and enzymes amount as independent variables， and taking the DH of earthworm powder as dependent variable， L9（43） orthogonal experimental table was used to carry out the experiment. The results showed that the influence degree of those factors to DH of earthworm powder in turn was： pH> enzymolysis temperature> enzymolysis time> enzymes amount. The best process condition was as follows： the enzymolysis time 8 h， the enzymolysis temperature 55 ℃， pH=8， and enzymes amount 3 000 U. Under above conditions， the DH was up to 52.96%.

Key words： Earthworm powder; Orthogonal experiment; Elastase; Trypsin; DH

地龍，又名蚯蚓、曲蟮，為蚯蚓的干燥體。地龍是我國重要的傳統中藥材，古典中記載其有平肝息風、通經活絡、平喘、利尿等作用[1，2]。近年研究表明，中藥地龍的化學成分有蚓激酶、蛋白質、氨基酸等，其中包括了人體必需的8種氨基酸[3]?，F代研究指出，地龍具有抗凝血、抗血栓、解熱、抗炎、鎮痛等作用[4]，其抗腫瘤作用成為研究熱點之一。

從古至今，地龍的炮制方法有酒制法、滑石粉炒制、蛤粉炒制、醋制等，臨床所用煎煮液存在服用量大、易被污染等不足[5]。有研究表明，動物類藥材有效活性成分主要為小肽[6]。且從蛋白質中得到的小肽，可作為研發和開發新藥的先導物[7]。有實驗結果證明地龍粉酶解最佳用酶為彈性蛋白酶和胰蛋白酶混合使用[8]。本實驗擬采用此兩種酶混合使用，以溫度、時間、pH和酶用量為變量因素，以水解度為指標設計正交實驗優化地龍粉酶解工藝。

1 ?實驗部分

1.1 ?儀器[8]

FA1204B電子天平（上海天美天平儀器有限公司）;遠紅外輻射干燥箱（上海陽光實驗儀器有限公司）;PHS-25pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）;HH-4數顯恒溫水浴鍋（上海梅香儀器有限公司）SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）;ST 16R高速冷凍離心機[賽默飛世爾科技（中國）有限公司];UV9100B型紫外可見分光光度計（北京萊伯泰儀器有限公司）;KQ-500GVDV型雙頻恒溫數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 ?試劑

乙醇（無水乙醇）、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉（國藥集團化學試劑有限公司）;D-果糖（北京西中化工廠）;水合茚三酮（上海源聚生物科技有限公司）;彈性蛋白酶（ 上海源葉生物科技有限公司）;甘氨酸、胰蛋白酶（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3 ?供試品

地龍粉（批號：20180201），購自安徽亳州。

2 ?實驗技術路線

2.1 ?標準曲線的繪制

2.1.1 ?茚三酮顯色劑的配制[9]

分別精密稱取磷酸二氫鉀6.00 g，茚三酮0.50 g，磷酸氫二鈉10.00 g， D-果糖0.30 g，加蒸餾水置于燒杯中溶解，再定容至100 mL，得新鮮茚三酮顯色劑以備用。

2.1.2 ?甘氨酸標準曲線的繪制

精密稱取干燥至恒重的甘氨酸0.100 0 g，用蒸餾水溶解后轉移至100 mL容量瓶定容，用移液槍精準取出2.00至100 mL容量瓶中定容，得20 ?g/mL 的溶液，分別從中取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL定容至10 mL，配成濃度為0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 ?g/mL的標準溶液，分別取2.00 mL稀釋液于干燥潔凈的具塞試管中，分別加入1.00 mL已配制好的新鮮茚三酮顯色劑，混勻后于100 ℃水浴鍋中加熱15 min，取出后放冷至室溫，分別加入5.00 mL配制好的 40%乙醇溶液（現配現用）混勻，放置15 min，置于紫外可見可見分光光度計中，設定波長570 nm處測定吸光度A，再繪制標準曲線。

2.2 ?地龍粉水提液的制備

精密稱取1.000 0 g地龍粉，置于100 mL干燥潔凈的具塞錐形瓶中，加30 mL蒸餾水，置于超聲提取器中，進行超聲30 min，按照實驗方案所設條件處理。酶解過程中保持溫度和pH值的恒定，pH值每隔1 h調1次。酶解結束，在4 ℃，3 000 r/min條件下離心10 min后進行抽濾。所得濾液定容至100 mL，得供試品溶液。將供試品溶液按照2.1.2項方法測定水解度。

凱氏定氮法測定地龍凍干粉總氮量[10]。

2.3 ?水解度的計算

按照2.1項及2.2項方法可計算地龍粉中游離氨基含量，可得出地龍粉中總氮量，再換算為氨基含量。按照下列公式計算水解度（DH）。

水解度（DH）%=肽鍵數已水解/總肽鍵數原料中×100%=（B-C）/（A-C）×100%

式中：A為地龍粉中總氮數;B為地龍粉經蛋白酶酶解后的游離氨基氮數;C為地龍粉水提液中游離的氨基氮數。

2.4 ?單因素實驗

2.4.1 ?pH對地龍粉水解度的影響

以地龍粉經酶解后的水解度為參考標準，在固定酶解時間4 h，固定酶解溫度35 ℃，固定加酶量2 000 U的條件下，測定不同pH（6，7，8，9，10）水平下地龍粉的水解度。

2.4.2 ?溫度對地龍粉水解度的影響[11，12]

以地龍粉經酶解后的水解度為參考標準，在固定pH=8，固定加酶量2000 U，固定酶解時間4h的條件下，測定不同溫度（40，45，50℃，55，60 ℃）水平下地龍粉的水解度。

2.4.3 ?時間對地龍粉水解度的影響

以地龍粉經酶解后的水解度為參考標準，在固定酶解溫度35 ℃，固定加酶量2 000 U，固定pH=8的條件下，測定不同時間（4，5，6，7，8 h）水平下地龍粉的水解度。

2.4.4 ?加酶量對地龍粉水解度的影響

以地龍粉經酶解后的水解度為參考標準，在固定酶解時間4 h，固定pH=8，固定酶解溫度35 ℃的條件下，測定不同加酶量（1 500，2 000，2 500，3 000 U，3 500 U）水平下地龍粉的水解度。

2.5 ?正交實驗

通過單因素實驗，各個因素篩選出三個水平，采用L9（43）正交實驗表設計四因素三水平的正交實驗。

2.6 ?數據處理

使用spss軟件處理正交實驗數據結果。

3 ?實驗數據分析

3.1 ?標準曲線

以甘氨酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標所得標準曲線為Y=0.467X+0.001 9（r2=0.998 6）。

用凱氏定氮法測得1.000 0 g地龍粉中總含氮量為52.048 mg。

3.2 ?單因素實驗結果

3.2.1 ?酶解時間對水解度的影響

據圖1可知，在4～6 h范圍內，水解度呈現先升高，在6 h達最大，而后持平的趨勢。原因可能是在一定酶解時間內，底物水解度與酶解時間呈正相關，在6 h時達到飽和。由于時間延長，地龍粉逐漸被轉化，其中大分子蛋白質被分解為小分子物質[13];同時也與蛋白酶自身壽命有關[16]，兩者綜合影響導致水解度下降。因此選定6、7、8 h作為正交實驗中地龍粉酶解時間的三個水平。

3.2.2 ?酶解溫度對水解度的影響

從圖2中可看出在35～60 ℃范圍內，35～55 ℃時持續上升，55 ℃時水解度達最大，據此可推測彈性蛋白酶與胰蛋白酶混合后在55 ℃時的體外活性最佳。原因可能是溫度較低時酶的活力較低，而溫度過高酶的空間結構會遭到永久性破壞，致使水解度降低[16]。因此選定50、55、60 ℃為正交實驗中地龍粉酶解溫度的三個水平。

3.2.3 ?pH對水解度的影響

從圖3可看出在pH=6～10的這段范圍里，水解度先上升，到pH=8時達到最大，然后下降。有研究也表明彈性蛋白酶和胰蛋白酶的適宜pH為弱堿性環境[14-16]。因此選定pH=7、8、9為正交實驗中地龍粉酶解所用pH的三個水平。

3.2.4 ?加酶量對水解度的影響

據圖4可知，在1 500～3 500 U范圍內，水解度呈現先升高而后持平的趨勢，在3 000 U時達持平。表明在3 000 U時1.000 0 g地龍粉所需蛋白酶用量達到飽和。因此選定2 500、3 000、3 500 U為正交實驗中地龍粉酶解所用加酶量的三個水平。

在單因素實驗基礎上，選取四個因素（時間、溫度、pH、加酶量），每個因素選取三個水平，如表1所示。

3.4 ?最佳工藝條件的驗證[17]

根據所篩選的最佳工藝條件（8 h，55 ℃，pH=8，3 000 U），在此條件下進行三次平行實驗，實驗結果分別為53.46%、52.76%、52.66%，平均值為52.96%。

4 ?討 論

地龍是傳統的蟲類中藥，其主要成分為蛋白質、氨基酸等。經酶解工藝處理的蛋白質，可降解成小分子肽和氨基酸[18]，具有毒性低、靶向性高、易吸收等優勢[16]。在之前的研究工作中用五種蛋白酶對地龍粉進行酶解，經過篩選最終確定地龍粉酶解用佳酶為彈性蛋白酶和胰蛋白酶。據此本實驗采取彈性蛋白酶和胰蛋白酶混合使用來對地龍粉進行酶解且對酶解條件進行優化。

經過單因素實驗及正交實驗優選出最佳酶解工藝為A3B2C2D3，即酶解時間8 h，酶解溫度55 ℃，pH=8，加酶量為3 000 U，在此條件下水解度高達52.96%。且經過方差分析，溫度、pH、加酶量、時間四種因素均為地龍粉酶解工藝的主要影響因素，這將為下一步制備新藥、抗腫瘤研究提供依據。

參考文獻：

[1]郭征兵.中藥地龍的藥理作用及活性成分分析[J].當代醫學，2017，23（19）：199-200.

[2]王春玲.中藥地龍的活性成分與藥理作用研究[J].亞太傳統藥，2015，11（07）：53-54.

[3]汪文琪. 中藥地龍的活性成分和藥理作用研究進展[A]. 中華中醫藥學會.中華中醫藥學會中藥化學分會第九屆學術年會論文集（第一冊）[C].中華中醫藥學會：中華中醫藥學會，2014：6.

[4]杜航，孫佳明，郭曉慶，張輝.地龍的化學成分及藥理作用[J].吉林中醫藥，2014， （34）：707-708.

[5]王艷，楊培民，代龍，劉國飛.水蛭提取方法及生理活性的研究[J].中國生化藥物雜志，2012，33（01）：27-29+33.

[6]王愛華，柳美玲，戴志明，等.小肽的吸收機制與營養價值研究進展[J].上海畜牧獸醫通訊，2008，2：7.

[7]王克夷.開發小肽篩選新藥[J].中國生化藥物雜志，2003，24（1）：48.

[8]呂迎蘭，劉穎，王彥多，等.地龍粉酶解用酶初步篩選[J].山東化工，2018，47（5）：20-22.

[9]丁永霞. 茚三酮顯色分光光度法測定食品中α-氨基酸含量的方法探討[J]. 食品工程，2017（01）：55-57.

[10]中國藥典2010年版.一部[S].2010：附錄53-54.

[11]Kaur M， Tripathi K， Gupta M， et al. Production and Partial characterization of elastase of Bacillus subtilis isolated from the cervices of human females[J]. Canad.J. Microbiol，1988 （3） ： 855-859.

[12]Kothayr M， K reger ?A. Purifieation and characterization ?of an elastolytic protease of V- ibrio vulnificus[J].J.Gener Microbiol，1987 （3）：1783-1791.

[13]溫志鵬，耿予歡，許彩虹，邊興偉.響應面法優化蛋白酶酶解海帶蛋白的工藝研究[J].食品工業，2019，40（01）：112-116.

[14]劉小杰，陳啟和，孫橋. 彈性蛋白酶的研究進展[J]. 中國食品添加劑，2004（04）：29-32.

[15]曹芮，單成海，陳銘. 胰蛋白酶法提取洋蔥多糖工藝[J]. 北方園藝，2018（06）：106-111.

[16]劉穎，朱曉明，王彥多，曹廣超，施東方，呂迎蘭，王集會，史磊. 正交實驗優化美洲大蠊粉混合酶酶解工藝[J]. 當代化工， 2018， 47 （06）： 1131-1134.

[17]史磊，劉春雨，張盼盼，王彥多，王穎，王集會.正交實驗法優選發酵蜈蚣粉中水溶性總蛋白提取工藝及其抗腫瘤效果[J].山東中醫雜志，2017，36（08）：710-713.

[18]王詩琦，劉顯軍，陳靜，李建濤.蛋白質飼料的酶解工藝及酶解蛋白在畜牧生產中的應用[J/OL].動物營養學報：1-7.