銀杏葉黃酮化合物提取和純化研究進展

李琦

摘 ?????要：系統歸納總結了銀杏葉黃酮化合物提取和純化方法，從提取率、提取純度、工業化適用性和環保性等角度，詳細分析了溶劑提取法、酶輔助提取法、微波提取法、超聲波提取法和超臨界CO2萃取提取法的優缺點;并根據銀杏葉黃酮化合物的結構差異性，對其純化方法-膜分離、大孔樹脂和聚酰胺分離等研究現狀系統地總結對比;最后，對銀杏葉黃酮化合物的提取開發技術提出建議和展望。

關 ?鍵 ?詞：銀杏葉;黃酮;提取;純化;研究進展

中圖分類號：S713; ?R284.2 ??????文獻標識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2019）04-0812-04

Abstract： Extraction and purification methods of flavonoids from Ginkgo biloba leaves were introduced， including organic solvent method， enzyme-assisted method， microwave-assisted method， ultrasonic method， supercritical CO2 extraction method and so on. Their advantages and disadvantages were discussed from the aspects of extraction yield， extraction purity， industrial applicability and environmental protection effect. Furthermore， the research progress of membrane separation， microporous resin and polyamide resin purification methods were systematically reviewed. In the end， the development trend of extraction and purification technologies of Ginkgo biloba leaf flavonoids was prospected.

Key words： Ginkgo biloba leaves; Flavonoids; Extraction; Purification; Research progress

我國植物資源豐富，對天然植物的根莖葉進行提取純化可得到具有多種生物活性的化合物，對我國食品、醫藥和保健品等行業的發展具有重要意義。銀杏葉提取物的主要活性成分為銀杏葉黃酮，具有清除自由基、抗氧化和改善心腦血管循環等多種功能，可以起到預防和治療心腦血管等疾病的作用。由于來源于天然產物，且具有優異生物活性，而被廣泛應用于化妝品、保健品和醫藥等多種領域。銀杏葉黃酮的提取與功能應用研究一直是天然產物研究的熱點之一[1]，已有多篇論文對銀杏葉提取物研究現狀進行綜述報道，如徐芳[1]、陳西娟[2]等[3]對銀杏葉黃酮的化學結構、藥理臨床應用、提取工藝等研究進展進行闡述，但對銀杏葉黃酮的純化精制、性能和構效關系等概括還不夠系統。

本文則系統地對銀杏葉黃酮提取方法優缺點進行概括比較，分析銀杏葉黃酮膜分離、樹脂法、柱層析分離純化技術研究現狀，并對銀杏葉黃酮提取純化技術發展進行展望。

1 ?銀杏葉黃酮的提取方法

根據提取過程采用的供能方式（如微波和超聲波）、體系（如溶劑和超臨界流體）以及其它輔助物質等，銀杏葉黃酮化合物提取方法主要有溶劑浸提法、酶輔助法、微波法、超聲波法和超臨界流體法等。

1.1 ?溶劑浸提法

溶劑浸提法是目前應用最廣泛的銀杏葉黃酮提取方法[4]。文獻報道中所浸提用溶劑多采用極性較大的乙醇水體系，例如，薛志彬[5]利用70%乙醇作為浸提所用的溶劑，在80 ℃下，提取3.0 h，總黃酮純度達16.13%。賈長英[6]等研究發現乙醇溶劑浸提條件的影響規律如下：乙醇體積分數>料液比>浸提時間>浸提溫度。乙醇水體系作為溶劑，相比其它大極性溶劑如丙酮等，毒性小，殘留處理方便;溶劑提取法方便、操作簡易，然而存在提取率低、操作時間長、材料浪費等弊端。

1.2 ?酶輔助提取法

由于植物中的活性成分多存在于根莖葉中，而根莖葉中主要結構組織成分為三大素-纖維素、半纖維素和木質素，均為聚合的高分子化合物，且具有穩定密集的結晶區，三大素的緊密結構導致植物中活性成分更難被提取，采用溫和的生物酶技術破壞三大素結構來提高活性成分的提取效果是近年來植物提取發展的新技術[7]。銀杏葉黃酮多存在于銀杏葉細胞內，銀杏葉細胞壁主要成分是纖維素，利用纖維素酶破壞細胞壁結構，可使細胞內的黃酮更多地溶解于溶劑中[8]。因此，生物酶技術也逐步被用于銀杏葉黃酮的提純技術中，在提純過程中，利用纖維素酶先降解細胞壁中纖維素，釋放出細胞壁中黃酮，可大幅度增大銀杏葉黃酮的提取率，而且，提純結束可通過瞬間升溫等方式，將生物酶殺死，不會在目標產物中殘留含有毒副作用的物質。吳梅林[9]等利用纖維素酶輔助法提取銀杏葉總黃酮，與乙醇浸提提取法相比，總黃酮得率提高了18.92%;CHEN Shuo [10]利用纖維素酶法提取銀杏葉黃酮，同時加入麥芽糖作為糖基，促進黃酮苷配基的轉糖基作用，使苷元轉變為極性更大的苷，從而使更多的有效成分溶解于提取液中，比在相同條件而無酶時產率提高了102%。酶輔助法可大幅度提高提取率，而且環保、安全性好等，所得提取物可用于食品和營養品添加應用。

1.3 ?微波輔助提取法

微波輔助提取技術具有副產物少，速度快和產率高等優點，已經被廣泛應用于黃酮的提取[11，12]。徐春明[13]等利用微波輔助乙醇溶劑法提取銀杏葉總黃酮，得出較佳的提取條件，在溫度70 ℃，料液比為1∶25，乙醇體積分數70%，微波功率300 W，微波時間60 s的條件下提取銀杏葉，總黃酮的提取率可達到2.698%。但微波溫度過高會破壞黃酮類物質結構，且更容易溶解出更多的雜質，且當功率較大溫度較高時，溶劑很易揮發，造成一定污染。因此，微波提取法在提取功率和溫度上有待進一步優化，如控低溫而保持微波功率的作用。

1.4 ?超聲波輔助提取法

豁銀強[14]利用超聲波技術提取銀杏葉黃酮，在70%乙醇作為浸提液，超聲功率100 W條件下，將超聲輔助乙醇浸提，在提取時間50 min，液料比為30∶1時，得到銀杏葉黃酮的提取率為3.51%。GAO Han [15]則先進行21.66 min超聲，再經39.34 ℃下2 h的提取，產品黃酮純度為40.62mg/g。超聲波輔助溶劑提取法，不需高溫條件，控制簡便[16]，但易形成超聲空白區，且設備制造成本較高。

超聲波和微波均是利用介觀尺度的能量波為能源，快速提取植物有效物的一種方法，其穿透度對植物提取作用影響較大。黃莉莉[17]探索了微波和超聲輔助提取銀杏葉有效成分過程中尺度的影響，通過理論分析微波和超聲波穿透深度的大小，確定兩種方法作用的尺度范圍，通過比較微波功率密度、輻射時間和料液比3個因素，發現在50 ℃以下，超聲波法提取率均明顯高于微波輔助提取法。

1.5 ?超臨界CO2提取法

何擴[18]利用超臨界CO2提取法，提取率為3.27%，純度為64.7%;韓玉謙[19]等用超臨界CO2提取法，同樣條件下，采用乙醇提取法所得銀杏葉黃酮的提取率僅為2.56%，質量分數為27.1%，而超臨界CO2法得到的黃酮提取率提高到3.95%，黃酮質量分數提高到35.28%。采用超臨界CO2提取銀杏黃酮，可大幅度提高提取效率 [20]，但由于工業化萃取設備的費用較大，仍不適宜用于大規模提純銀杏葉黃酮。

另外，在銀杏葉黃酮提取過程中，還可添加其它化學物質以增加收率等。例如，在體系中添加表面活性劑還可提高活性物質的溶解度和溶出速度，提高活性物質的收率，但所加化學助劑的殘留會對銀杏葉黃酮目標活性產物造成污染，并未被廣泛采用。

2 ?銀杏葉黃酮的純化方法

采用前面所述提取方法所得到的銀杏葉提取物中黃酮含量偏低，達不到相應行業標準，特別是藥用標準，還需要進行進一步精制純化，提高黃酮純度。純化銀杏黃酮最常用的方法是膜分離法、大孔樹脂和聚酰胺樹脂層析法。

2.1 ?膜分離法

膜分離是純化技術中較成熟穩定的方法，也被用于純化銀杏葉黃酮研究中。XU Zhihong[21]采用自制的PVDF-PVP膜對銀杏葉提取物進行精致提純，最終將黃酮純度從21.3%提高至34.8%，由于膜的制備采用氧化法，體系pH和壓力均對提取效果具有一定影響，pH的增加會導致提純效果變差。ZHU Minghang[22]采用超濾膜法純化銀杏葉黃酮，發現超濾膜MWCO（10 000 Dalton）效果最佳，可將銀杏黃酮純度從質量分數24%提高到68%，溫度是影響提純效果的最大因素。贠延濱[23]則采用三步驟的膜分離技術進行超濾提純銀杏葉黃酮粗提物，將黃酮的純度由24%提升到99.2%。膜分離能耗低，設備易放大;具有工藝簡單、節能、成本低的優點，且所得產品純度高，便于工業放大。

2.2 ?大孔樹脂法

由于大孔樹脂具有物化穩定高、吸附容量大、選擇性好、易再生等特點，利用大孔樹脂對銀杏葉提取物進一步純化的研究越來越受到關注。根據黃酮苷以及黃酮苷元的極性不同，采用不同濃度的乙醇-水溶液，利用大孔樹脂純化黃酮極為廣泛。吳梅林[24]用AB-8大孔吸附樹脂在pH =5、流速為1.0 mL/min、70%乙醇為洗脫劑純化銀杏葉總黃酮，純度提高至26%;吳昊[25]用S-8大孔樹脂，對粗黃酮粉純化，黃酮的純度達48.03%。倪力軍[26]研究發現銀杏葉中黃酮的含量對采用大孔樹脂純化銀杏葉具有重要影響，選用黃酮含量分別為1.0%、0.8%和0.6%的三批銀杏葉，研究發現0.6%黃酮含量的工藝參數最為敏感，提取物中黃酮含量與乙醇濃度和洗脫液體積成正相關，提取物得率與洗脫液體積負相關，并得到較佳的純化銀杏葉黃酮的工藝，在保持原料銀杏葉中的黃酮含量為1%左右時，以2倍質量15%乙醇進行洗脫，可獲得符合中國藥典要求的銀杏葉提取物。孫勝武[27] 建立了基于黃酮類銀杏葉提取物的特征圖譜和總黃酮醇苷含量的綜合評分法，用于評價銀杏葉提取物的質量，使用AB-8大孔樹脂純化銀杏葉提取物，在體系pH=5.0，先后采用25%和75%乙醇洗脫，為銀杏葉提取物質量的評價方式提供新思路。

2.3 ?聚酰胺樹脂層析法

王永剛[28]利用70%乙醇洗脫，經聚酰胺樹脂純化洗脫后，黃酮純度可達到63.8%。ZHANG Jing[29]利用聚酰胺樹脂純化法，采用30%乙醇洗脫，黃酮純度提高可至55%。相比大孔樹脂，聚酰胺樹脂對銀杏葉黃酮的純化，具有更強的選擇性，具有更好的分離純化效果，但聚酰胺樹脂作為吸附劑，洗脫速度遲緩，且小分子量的聚酰胺容易霉變混入產品中，導致產品質量不穩定或下降。

此外，硅膠柱色譜、離子交換樹脂、離子液體/鹽雙水相體系和金屬絡合-解離法等也常用來作為銀杏黃酮的純化精制。

3 ?展 望

我國植物資源豐富，發展植物提取技術，對增加我國資源高效利用具有重要意義。全球對銀杏葉提取物的需求量日益增多，對銀杏葉黃酮的提取純度也有更高的要求，目前銀杏葉黃酮的提取和純化技術繁多[30，31]，基本能滿足醫藥食品等工業需求。此外，銀杏葉黃酮清除自由基的能力與其作為活潑氫供體的酚羥基有著密切聯系，銀杏葉黃酮的酚羥基基團具有很強的還原能力，容易被氧化，在提取純化和放置過程中均有一定不穩定性[32，33]，在以后的研究中可考慮采用適當技術，如減少提取物與空氣氧氣接觸機會或加抗氧化劑，消除結構不穩定性的影響。銀杏葉提取物在醫藥行業中的應用不僅要求銀杏葉黃酮含量達到一定值，還對其它副產物具有嚴格要求，如具有毒副作用的銀杏酸含量要低，對銀杏葉提取物的精密分離和分析技術同樣值得進一步研究[34];隨著多學科技術交叉協作發展，銀杏葉黃酮的提取和純化技術將逐漸提高和完善。

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