全清液發酵營養組學的精準控制

盧宗梅 周勇 楊儒文 劉夢涵 彭超 朱威宇 何太波 佟毅

摘 ?????要：以黑曲霉Co827菌株為試驗菌株，在淀粉全清液培養基的基礎上，以多尺度手段對培養基中的氮源、磷源對菌株產酸能力的影響進行研究。研究結果表明：黑曲霉Co827以淀粉糖液為碳源的全清液發酵培養基中，生長期（種子罐培養基）的碳氮比為30、氮磷比為3.2，產酸期（發酵罐培養基）的碳氮比為70，氮磷比為3.5。

關 ?鍵 ?詞：全清液;發酵;碳氮比;氮磷比

中圖分類號：TQ 921.1 ??????文獻標識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2019）04-0830-04

Abstract： Aspergillus Niger Co827 was used as the experimental strain. On the basis of starch clear medium， the effect of nitrogen and phosphorus sources on the acidogenicity of this strain was studied by multi-scale method. The results showed that Aspergillus Niger Co827 was fermented in pure fermentation medium with starch sugar solution as carbon source. During the growth period （seed tank medium）， the ratio of carbon to nitrogen was 30， the ratio of nitrogen to phosphorus was 3.2; the ratio of carbon to nitrogen in the acid-producing period （fermentation tank medium） was 70， and the ratio of nitrogen to phosphorus was 3.5.

Key words： ?full clear liquid ; fermentation; carbon nitrogen ratio; N：P ratio

檸檬酸是一種重要的有機酸，又名枸櫞酸，是動植物內的一種天然成分和身體代謝的中間產物，也是食品、醫藥、化工等領域應用最廣泛的有機酸之一，廣泛應用于工業、食品業和化妝業等領域。它是無色透明或半透明晶體，或粒狀、微粒狀粉末，無臭，有很強的酸味，但令人愉快，稍有澀味。易溶于水，在溫暖空氣中漸漸風化，在潮濕空氣中微有潮解性。檸檬酸晶體有兩種，36 ℃以上結晶出來不含結晶水的為無水檸檬酸，36 ℃以下結晶出來帶有一個結晶水的為一水檸檬酸[1]。

目前，檸檬酸生產中基本采用的都是玉米粉液化液加過濾清液的粗獷發酵控制方式。由于培養基營養成分由玉米粉液化液提供，其中成分復雜且波動大，生產不易控制。因此，為了實現發酵過程的精準控制，通過開發全清液培養基并實現營養組學的精準控制，氮源和磷源是其中最為重要的兩種營養。

氮源分為有機氮源和無機氮源，黑曲霉可以利用很多無機和有機氮源，尤其偏好于無機氮源[2]。并且在發酵檸檬酸中途添加NH+4鹽也有優越性。國內對玉米粉檸檬酸發酵研究已經非常成熟。研究檸檬酸發酵氮源種類的有很多。以薯干粉為原料發酵生產檸檬酸和以玉米粉液化濾液為基料，添加玉米粉調整氮源發酵生產檸檬酸，培養基中蛋白質含量與產酸情況的研究[3]。添加適量的有機氮源對檸檬酸產量具有促進作用[4]。玉米粉檸檬酸發酵中液化條件影響糖液中溶磷水平，對檸檬酸發酵高產酸非常重要[5]。然而，在全清液檸檬酸發酵的研究過程中，并沒有對氮磷的精準控制進行系統和深入的研究。

本文以淀粉全清液檸檬酸發酵培養基為基礎，對碳氮磷的關系進行研究，從而達到檸檬酸發酵營養的精準控制，提高發酵水平。

1 ?實驗部分

1.1 材料

1.1.1 ?材料

供試驗菌種：黑曲霉（Aspergillus niger）Co827，由中糧生物化學（安徽）股份有限公司提供。

淀粉：普通商品淀粉，由中糧生物能源（榆樹）有限公司提供。

玉米粉、a-耐高溫淀粉酶、糖化酶等均由中糧生物化學（安徽）股份有限公司提供。

1.1.2 ?設備與儀器

高百特全自動5 L發酵罐、金怡牌HH-S2數顯恒溫水浴鍋、金怡牌JJ-1増力電動攪拌器;電子調溫電爐;美國Extrel公司MAX300-LG質譜儀高精度尾氣在線快速分析系統、INNOVA搖床、1 000 mL燒杯、250 mL三角瓶。

1.1.3 ?培養基

商品淀粉加水調漿至20%濃度，調整pH至5.7，添加a-淀粉酶加熱至95 ℃保溫20 min開始碘試，當碘試呈紅棕色即合格。

以玉米漿、硫酸銨、磷酸氫二鉀等為營養鹽調整培養基中的氮、磷。

1.2 ?方法

1.2.1 ?種子罐碳氮比、氮磷比正交搖瓶試驗

淀粉制備的糖液、玉米漿、硫酸銨、磷酸氫二鉀按照總糖（9%、10%、11%、12%）、碳氮比（20、25、30、35）、氮磷比（2.5、3.0、3.5、4.0）三因素四水平進行正交搖瓶試驗，具體見表1。

搖瓶培養基按照表1的正交表配制好以后，每組3個平行搖瓶，250 mL三角瓶裝培養基50 g，用三層紗布一層牛皮紙封口包扎121 ℃滅菌25 min，降溫至常溫后，在無菌環境中接黑曲霉孢子1 500萬個/瓶，然后稱重W，放入搖床內36 ℃、400 r/min條件下培養26 h取下。對每個搖瓶復重至W，然后做顯微鏡觀察并過濾檢測酸度和pH。

試驗證明，調整后使種子罐和發酵罐的培養基營養都得到了均衡，而且在一定范圍內，只要達到營養的均衡，發酵周期和轉化率波動都不大。最高能夠做到56.2 h，產酸214.40 g/L水平，見表5。

3 ?結果與討論

3.1 ?碳氮磷比例對菌球形態的影響

對于黑曲霉檸檬酸發酵來說，菌球形態也是影響高產酸的重要因素。菌球松緊適度且小而規則，增大了菌球與介質的接觸面積，而且有利于物質傳輸，因此產酸濃度高、速率快。由于在培養基中，產物檸檬酸需要碳源來轉化，因此碳源是過量的，這樣，菌體的生長主要靠氮磷來調節。既要控制好菌體生物量，同時也要控制好碳源與生物量之間的比例。合適的碳氮磷比例，有利于菌球的均衡生長。

3.2 ?總糖對產酸速率和轉化率的影響

當培養基中營養達到均衡時，總糖對轉化率和周期的影響不顯著。是在碳、氮、磷達到某種平衡的條件下，也就是說，培養基中一種營養變動而其他營養也需要隨之而調整，使各種營養達到一種平衡。如果在某一種培養基配方中單獨調整總糖濃度，則發酵產酸和周期等肯定會隨著而發生較大變化。當培養基調整總糖時，氮、磷等營養需要隨之調整以保持一定平衡。

4 ?結 論

本文主要研究了發酵培養基中的碳氮磷平衡問題，從而開發出全清液檸檬酸發酵工藝。為了達到高速產酸和高收率，培養基中的碳氮磷等需要保持動態的平衡。種子罐培養基總糖11%，碳氮比30，氮磷比3.2時，種子的質量大幅度提升。發酵罐培養基在一定的范圍內調整總糖時，保持碳氮比70，氮磷比3.5時，可以得到高效發酵水平。

參考文獻：

[1] 王博彥，金其榮.發酵有機酸生產與應用手冊.北京：中國輕工業出版社，2000-01：124-149.

[2]夏勝潔.不同氮源對檸檬酸發酵的影響[R].石河子長運生化有限責任公司832000.

[3]孫維國.部分有機氮源對檸檬酸發酵的影響[R].寧夏寧馨兒生物工程股份有限公司.

[4]張偉心，王建平，等.有機氮源對檸檬酸發酵的影響[J].河北大學學報：自然科學版，2000（2）.

[5]代真真，周勇，劉玉偉，滿云，張繼學，王永紅，等，檸檬酸發酵過程中液化條件的影響[D].華東理工大學生物工程學院，上海.

[6] 張嗣良，儲炬.多尺度微生物過程優化[M].北京：化學工業出版社，2003：230-289