響應面法優化玉米生料生產乙醇工藝的研究

王澤興 佟毅 袁敬偉 祁德福

摘 ?????要：以全玉米粉為原料，對生料發酵乙醇的工藝進行研究，通過單因素實驗以及響應面優化實驗探討原料粒度、底物濃度、生料酶添加量以及糖化酶添加量等因素對發酵的影響。結果表明，全玉米粉生料發酵乙醇的最佳工藝條件為50目全玉米粉為原料，底物濃度為37%，生料酶1.25%（w/w），加入酵母活化液（干酵母加量0.05%），并添加氮源尿素以及青霉素，恒溫32 ℃發酵85 h，酒份能夠達到19.86%（v/v），淀粉利用率為90.25%，響應面分析R-sq>80%，R-sq（調整）>80%，表示所建立的模型對異變有足夠的解釋能力。

關 ?鍵 ?詞：響應面法;生料發酵;酒精

中圖分類號：TQ 920.6 ??????文獻標識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2019）04-0834-05

Abstract： The fermentation process for producing ethanol with all corn flour as raw material was studied. The influences of raw material granularity， substrate concentration， raw enzyme dosage and glycosylase dosage on the fermentation were investigated through single factor experiment and response surface optimization experiment. The results showed that the best conditions for the fermentation process were as follows： the raw material 50 mesh corn flour， the substrate concentration 37%， the enzyme dosage 1.25%（w/w）， and the yeast activator 0.05% of dry yeast， adding nitrogen urea and penicillin， the constant temperature 32 ℃，the fermentation time 85 h. Under above conditions， the ethanol content reached 19.86%（v/v）， the starch utilization rate was 90.25%， the response surface analysis R-sq>80%， R-sq（adjustment）>80%， indicating that the established model was sufficient to explain the variation.

Key words： Response face method; Fermentation of raw materials; Alcohol

由于世界能源危機，伴隨著節能環保理念的誕生，日本人最早提出了生料發酵的概念。隨著酶工程的發展，我國的生料發酵研究應用發展迅速 [1]。從字面意思就能理解，生料發酵就是在發酵中不存在高溫蒸煮的過程，微生物直接作用于底物進行發酵。生料發酵與傳統熟料發酵相比，發酵條件溫和，節省了蒸煮過程帶來的能源消耗，從而降低生產成本費用，增強產品和企業的競爭力[2]。

生料發酵應用于酒精生產行業中，生料發酵生產酒精與熟料發酵生產酒精工藝對比，不存在蒸煮工段和冷卻糖化工段，這就減少了大約30%～40%的高壓蒸煮工段的能耗與汽耗，也減少了后續投入生產冷卻水的部分成本，進一步簡化工藝，使勞動強度大幅下降，降低生產成本[3，4]。

2017年9月，國家發改委、國家能源局、財務部等十五部委出臺的《關于擴大生物燃料乙醇生產和推廣使用車用乙醇汽油的實施方案》規定。按照規劃要求，2020年我國所有車用汽油均改為乙醇汽油，當前我國車用汽油表觀消費量為1.23億t，2020年我國汽油消費量將達到1.5億t，那么按10%組分計算，燃料乙醇消費量為1 500萬t，是當前消費量的5倍，市場空間巨大[5- 8]。

響應面分析法（Response Surface Methodology，簡稱RSM），對實驗數據進行合理化綜合分析，通過試驗設計、建立模型、分析模型合理性和尋求最優解等步驟，經過眾多試驗與統計技術論證，來解決實際生產中存在問題的有效方法，該方法在生物發酵方面已有廣泛應用[9-13]，本試驗采用全玉米粉為原料，進行單因素實驗研究后，通過響應面法對生料發酵生產燃料乙醇的工藝研究。

1 ?實驗部分

1.1 ?材料與試劑

1.1.1 ?試驗材料

全玉米粉，淀粉含量65.13%;安琪超級釀酒干酵母（安琪酵母股份有限公司生產）;生料預液化酶制劑（商品酶制劑）;生料酶（商品酶制劑）;葡萄糖（分析純）;氫氧化鈉（分析純）;鹽酸（分析純）;硫酸（分析純）;蘇宏GA475（諾維信公司糖化酶，酶活力10～13萬u/mL）;尿素;青霉素。

1.1.2 ?主要試劑

裴林試劑甲乙液、0.5%次甲基藍溶液、0.25%葡萄糖溶液。

1.2 ?儀器與設備

液相色譜（Agilent 1200 安捷倫科技發展有限公司）;顯微鏡（尼康50I）;分析天平（Mettler ML6002T 梅特勒- 托利多儀器上海有限公司）;離心機（3-18k Sigma 公司）;水浴鍋（HWS-28 上海一恒科技有限公司）;搖床（ZHWY-2112F 上海智城分析儀器制造有限公司）;黏度計（NDJ-5S 上海恒平科學儀器有限公司）;pH 計（FE-28 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

1.3 ?檢測方法

1.3.1 ?殘糖的測定方法

斐林試劑法[14]檢測發酵后殘還原糖、殘總糖、過濾總糖。

1.3.2 ?黏度的測定方法

使用黏度計NDJ-5 進行測定。

1.3.3 ?酵母測定

顯微鏡下觀察，血球計數板計數。

1.3.4 ?成熟醪內各個組分的測定方法

高效液相色譜法：采用安捷倫1200 型色譜進行測定，流動相：0.005 mol/L H2SO4;色譜柱：伯樂HPX-87H，300 mm×7.8 mm;泵流速：0.6 mL/min;柱溫：65 ℃;RID溫度：50 ℃;進樣量15 μL;運行時間30 min[15]。

1.4 ?實驗方法

1.4.1 ?酵母活化

按照0.05%加入安琪超級釀酒高活性干酵母，稱取10 g干酵母至三角瓶中，加入143 g活化水（35 ℃一次水），攪拌均勻后，置于35 ℃的恒溫培養箱中，活化 20 min后取出，向發酵體系中添加2.5 mL活化液。

1.4.2 ?發酵實驗

取工廠生產線玉米原料，粉碎過篩，按照一定配料濃度進行拌料，調節pH至4.4～4.6，加入生料預液化酶制劑，在50～55 ℃下浸泡1 h，在60～65 ℃下保持0.5 h后冷卻至32 ℃，稱取液化醪300 g至錐形瓶中，加入酵母活化液、生料酶、尿素以及青霉素，恒溫32 ℃發酵85 h時。

1.4.3 ?醪液中乙醇含量數據檢測

依照液相色譜法檢測醪液中酒精含量。

1.4.4 ?單因素實驗

通過實驗考察原料粒度、發酵時間、生料酶加量、底物濃度4個單因素對玉米生料發酵效果的影響。

1.4.5 ?響應面優化實驗

以單因素實驗結果為基礎，采用Minitab軟件，以A（原料粒度）、B（發酵時間）、C（生料酶加量）、D（底物濃度）、Y（淀粉出酒率）作為響應指標，驗證各個單因素A、B、C、D交互作用對Y的影響，尋找各個單因素水平組成的最佳發酵條件。

2 ?結果與分析

2.1 ?單因素實驗結果

2.1.1 ?原料粒度對發酵的影響

取20目篩、40目篩、60目篩粉碎玉米原料，按30%濃度配料，調節pH至4.4，加入生料預液化酶制劑0.5%（w/w），在55 ℃浸泡1 h后再60 ℃水浴鍋中維持保持0.5 h，取出后冷卻至32 ℃，稱取液化醪300 g至錐形瓶中，加入酵母活化液（干酵母加量0.05%），加入生料酶1.0%（w/w），尿素以及青霉素，恒溫32 ℃發酵85 h（圖1）。

由圖1可以看出，隨著原料粒度的增加，粉碎粒度越細，試驗組酒份逐漸增加，但通過圖中數據能夠看到隨著原料粒度的增加，發酵殘總糖也會隨之升高。粒度增加，導致淀粉粒越小，這就使總體的淀粉顆粒表面積增加，并且越容易形成懸濁液，糖化酶和酵母與淀粉顆粒發生相互作用幾率增加，化學反應就更加充分，有利發酵的順利進行[16]。但是如果將淀粉顆粒粉碎的越細，越小，該過程中消耗能源也將隨之增長，且增加明顯。因此并不是顆粒越小越好。故而綜合多方面因素，選擇40目粒度進行發酵是比較恰當的。

2.1.2 ?底物濃度對發酵的影響

取40目全玉米粉，分別按照20%、25%、30%、35%、40%濃度進行配料，調節醪液pH至4.4，加入生料預液化酶制劑0.5%（w/w），在55 ℃浸泡1 h后再60 ℃水浴鍋中維持保持0.5 h，取出后冷卻至32 ℃，稱取液化醪300 g至錐形瓶中，加入酵母活化液（干酵母加量0.05%），加入生料酶1.0%（w/w），尿素以及青霉素，恒溫32 ℃發酵85 h（圖2）。

從圖2可以看出，隨著配料濃度的增加，乙醇含量也隨之增加，這和RASMUS D 等的報道的結論相同[17]，本實驗中酒份在35%時達到最高，爾后40%濃度下的乙醇含量略低于35%濃度。底物濃度增加，糖含量也增加，酵母可利用的糖非常充分，而在增加到一定程度時，較高的糖含量以及乙醇會抑制酵母的生長活動，導致乙醇產率降低[18]，并且過高的發酵濃度會對后期蒸餾工序帶來較大負擔，故而平衡生產才能產出最大效益，通過實驗數據可以看出，配料濃度在35%時能夠達到乙醇最大產量。

2.1.3 ?發酵時間對發酵的影響

取40目全玉米粉，配料濃度30%，調節醪液pH至4.4，加入生料預液化酶制劑0.5%（w/w），在55 ℃浸泡1 h后再60 ℃水浴鍋中維持保持0.5 h，取出后冷卻至32 ℃，稱取液化醪300 g至錐形瓶中，加入酵母活化液（干酵母加量0.05%），加入生料酶1.0%（w/w），添加氮源尿素以及青霉素，恒溫32 ℃發酵，分別在發酵75、80、85、90 h取樣進行檢測（圖3）。

由圖3可以看出，隨著發酵時間的增加，酒份逐漸增高，并且在發酵85 h酒份達到最高，后續再進行發酵，酒份反而出現降低的情況，在發酵達到一定時間后，隨著乙醇的產出變慢，乙醇的含量隨著揮發、發酵醪內形成其他化合物等因素，導致發酵時間過長會影響酒精得率[19]，根據實驗數據，優先選擇發酵85 h。

2.1.4 ?生料酶加量對發酵的影響

取40目全玉米粉，配料濃度35%，調節醪液pH至4.4，加入生料預液化酶制劑0.5%（w/w），在55 ℃浸泡1 h后再60 ℃水浴鍋中維持保持0.5 h，取出后冷卻至32 ℃，稱取液化醪300 g至錐形瓶中，加入酵母活化液（干酵母加量0.05%），分別制定生料酶加量為0.5%1.0%、1.5%、2.0%（w/w），并添加氮源尿素以及青霉素，恒溫32 ℃發酵85 h（圖4）。

隨著生料酶加量增大，發酵乙醇含量也隨之增加，可以看出從0.05 kg/t玉米粉增加至0.1 kg/t玉米粉時，乙醇含量增加明顯，再從0.1 kg/t玉米粉向上增加時，乙醇含量是增加趨勢，但增加的幅度逐步變小，說明在生料酶加量在0.1 kg/t玉米粉時，既能夠達到發酵乙醇含量最大化，并且可以維持在較低的成本條件下。

2.2 ?響應面優化實驗的結果和分析

為了明確全玉米粉生料發酵的工藝最佳組合，通過以上單因素實驗的結果，選取A-原料粒度、B-發酵時間、C-生料酶加量、D-底物濃度自變量，乙醇酒份（Y）為響應值，進行響應面分析實驗，結果見表2-4和圖5-10。

在圖5中，是原料粒度和發酵時間交互作用對酒份的影響，當固定生料酶和底物濃度時，原料粒度從20目增加至60目，發酵時間從80 h增加至90 h，酒份均呈現先增大后減小的趨勢，曲面的頂點即為酒份最大值。

由表2可以看出，R-sq>80%，R-sq（調整）>80%，表示所建立的模型對異變解釋能力足夠，A、B、C、D、AA、BB、CC、DD對酒份的影響具有極顯著性（P<0.05），由F值的大小可知，影響酒份的主次順序為：C>D>B>A，即生料酶加量>底物濃度>發酵時間>原料粒度，將酒份取最大值，軟件自動分析得到最優條件為：原料粒度在47.07目，底物濃度在36.56%，生料酶加量在1.2475%（w/w），發酵時間在86.11 h，此條件下，酒份能夠達到19.95%（v/v），為便于實際操作與應用，將各個條件選取優化為原料粒度在50目，底物濃度在37%，生料酶加量在1.25%（w/w），發酵時間在85h，酒份達到19.86%（v/v），淀粉利用率為90.25%。

3 ?結 論

利用MiniTab軟件的響應面法，研究優化玉米生料發酵乙醇的工藝，通過分析可以得到影響因素中生料酶的加量對發酵酒份的影響最大，糖化酶添加量次之，原料粒度最小，形成的數學模型顯著性良好。通過軟件最優解得到玉米生料發酵乙醇的最佳工藝條件為50目全玉米粉為原料，底物濃度為37%，生料預液化酶制劑0.5%（w/w），生料酶1.25%（w/w），加入酵母活化液（干酵母加量0.05%），并添加氮源尿素以及青霉素，恒溫32 ℃發酵85 h，酒份能夠達到19.86%（v/v），淀粉利用率為90.25%。

參考文獻：

[1]朱文優，劉 軍.生料發酵技術概述[J]. 糧食與食品工業， 2006， 13 （3）： 38-41.

[2]阮彩彪，何 建，等. 生料發酵技術應用概述[J]. 中國釀造， 2010， 1 （1）： 4-8.

[3]薛正蓮，玉米生粉酒精發酵的研究[J]. 安徽機電學院學報， 1996， 11 （2）： 68-71.

[4]汪江波，薛海燕，鄒玉玲，等，酶制劑的添加對早秈稻谷生料發酵生產酒精的影響[J]. 中國釀造，2005 （4）：15-17.

[5]玉瓊廣，梁露鋒. 酒精工業發展簡析 [J]. 輕工工業，2018.10：43-45

[6]門秀杰，孫海萍，等.我國推廣乙醇汽油的進展、影響及應對建議[J]. 現代化工，2018（11）： 8-11+13.

[7]田廣武. 我國擴大生物燃料乙醇生產和推廣使用車用乙醇汽油的問題與建議[J]. 國際石油經濟，2018（9）： 83-86.

[8]岳國君. 生物燃料乙醇產業迎來發展好時機[J]. ?生物產業技術，2018（4）：1.

[9]江元翔，高淑紅，陳長華. 響應面設計法優化腺苷發酵培養基[J]. 華東理工大學學報， 2005， 31（3）： 309-313.

[10]陸燕，梅樂和，陸悅飛，等. 響應面法優化工程菌產細胞色素[J]. 化工學報， 2006， 57（5）： 1 187-1 192.

[11]郝學財，余曉，劉志，等. 響應面方法在優化微生物培養基中的應用[J]. 食品研究與開發， 2006， 27（1）： 38-41.

[12]蔣丹丹，張彬，梁志宏，等. 響應面法優化降膽固醇馬紅球菌F21-1的發酵培養基[J]. 中國農業大學報， 2008， 13（2）：20-24.

[13]Hong G， Mei L， Jintao L， et al. Medium optimization for the production of avermectin B1a by Streptomyces avermitilis 14 -12A using response surface methodology[J]. Bioresource Technology，2009， 100（17）： 4 012-4 016.

[14]王福榮.釀酒分析與檢測[M].北京： 化學工業出版社，2005.

[15]劉文信. HPLC 在酒精發酵醪液檢測中的應用[J]. 化學工程師， 2013，（2）：28-30.

[16]謝碧霞，李安平等. 響應面法優化橡實淀粉生料發酵生產燃料酒精工藝[J]. 中南林業科技大學學報， 2010，（12）：92-97.

[17]RASMUS D，SEVEN P，LISBETH O. ?Characterization ?of ?very ?high ?gravity ?ethanol ?fermentation ?of ?corn ?mash， effect ?of ?glucoamylase ?dosage， pre-saccharification ?and ?yeast ?strain[J]. Applied ?Microbiol ?Biot， 2005，68（9）;622-629.

[18]楊小沖. 釀酒酵母酒精耐受機理的研究及其在果酒生產中的應用[J]. 內蒙古農業大圩，2018：71.

[19]張強. 高濃度酒精發酵技術研究進展[J]. 釀酒科技， 2018（11）：1-5.