小鼠抗狂犬病毒IgG抗體ELISA檢測方法的建立

蔡方舟，陳 倩，佟 巍，李 丹，王 衛

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，新發再發傳染病動物模型研究北京市重點實驗室，國家衛生健康委員會人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021)

狂犬病是一種由狂犬病毒(rabies virus, RV)感染引起的急性傳染病，是迄今為止唯一病死率高達100%的烈性傳染病[1-2]。我國是世界第二大狂犬病高發國，僅次于印度；1949年至2015年，我國大陸報告狂犬病130494例，平均每年1977例[3]。近年來，在全社會的重視和努力下，我國狂犬病病例持續下降，但發病數和死亡數在法定傳染病報告里依然排列前茅，不可忽視[4]?？袢】煞啦豢芍?，合格的疫苗可用于狂犬病毒暴露前或暴露后預防；一旦發病，則無有效的治療方法或策略。因此，完善狂犬病動物模型，檢定狂犬病疫苗效價，探索狂犬病發病機制，對于狂犬病的防治均具有非常重要的現實意義。實驗小鼠具有遺傳背景均一、實驗操作簡便、實驗試劑完善等優點，常用于狂犬病的發病機制研究及預防疫苗的評價[3]。

為了解狂犬病毒及疫苗對實驗小鼠的免疫效果，常需要檢測小鼠血清中抗狂犬病毒抗體水平。常用的檢測方法包括世界動物衛生組織(OIE)推薦的熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)，以及世界衛生組織(WHO)推薦的快速熒光灶抑制試驗(RFFIT)，可定量檢測動物或人體內狂犬病中和抗體水平；但缺少規范的結合抗體檢測方法。基于此，為完善狂犬病小鼠模型技術體系，本研究建立了一種基于間接ELISA法檢測小鼠血清中抗狂犬病毒IgG抗體的方法，可用于狂犬病小鼠模型的分析以及疫苗效價的評估。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級KM小鼠(雌性，體重12～14 g，3～4周齡)，由北京華阜康生物技術股份有限責任公司提供[SCXK (京)2014-0004]，用于狂犬病毒陽性血清和陰性血清的制備。動物飼養與實驗均在中國醫學科學院醫學實驗動物研究所生物安全二級動物實驗室(ABSL-2)，遵照3R原則進行。動物實驗方案得到中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準(批準號：WW18003)。

1.1.2 實驗樣品

狂犬病毒陽性血清和陰性血清由本課題組自行制備，具體方法詳見1.3.1。用于特異性實驗的小鼠肝炎病毒、小鼠呼腸孤病毒III型、小鼠細小病毒、小鼠多瘤病毒、小鼠腺病毒、小鼠仙臺病毒、小鼠腦脊髓炎病毒、淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒的陽性血清來自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所檢測中心，免疫熒光法(IFA)確認陽性，抗體效價均不低于1∶320。

1.2 主要試劑與儀器

狂犬病疫苗國家標準品購自中國食品藥品檢定研究院，批號為250009-201108，效價為6.61 U/mL?？袢《究乖A包被微孔板(96微孔板)、TMB顯色液、終止液(稀硫酸)、PBST洗液等購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司(批號：20180906)。HRP標記的山羊抗小鼠IgG抗體(貨號：ZB-2305WW)購于北京中杉金橋生物技術有限公司，抗體濃度為400 μg/mL。PBS(貨號：SH30256.01)購自HyClone公司。酶標儀(型號：FLUOStar Omega)由德國BMG Labtech公司生產。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠陽性血清及陰性血清的制備

狂犬疫苗國家標準品用PBS稀釋成1∶125，每只小鼠腹腔注射0.5 mL，0 d、7 d免疫，共免疫2次。分離免疫后14 d小鼠血清，進行抗狂犬病毒中和抗體效價快速熒光灶抑制試驗(RFFIT)測定。根據WHO指導原則，RFFIT結果大于0.5 IU/mL的樣品確定為陽性血清。陽性血清混合后，使用BSA方法測定其濃度為64.5 mg/mL。陰性血清來自未免疫小鼠，RFFIT實驗確認對狂犬病毒沒有中和效果。

1.3.2 ELISA方法的基本流程

狂犬病毒抗原包被由北京世紀元亨公司具體操作，其簡單流程如下：96孔板使用純化的狂犬病毒進行包被，包被時將包被液(0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液，0.05 mol/L堿)稀釋后加入微孔板中，每孔加100 μL，4℃孵育24 h，甩干；加入封閉液(0.12% Tris緩沖液，含蛋白)，每孔家200 μL，4℃孵育24 h，甩干。對包被板做干燥、密封等處理，保存于4℃冰箱。獲得狂犬病毒抗原包被板之后，向其中加入PBS稀釋的血清標本，37℃培養箱中孵育30 min；PBST洗板5次，加入PBS稀釋的HRP標記的山羊抗小鼠IgG抗體，37℃培養箱中孵育30 min；PBST洗板5次，加入顯色底物A(0.05 mol/L pH 5.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，含H2O2)及顯色底物B(0.01 mol/L pH 5.0檸檬酸緩沖液，含EDTA-Na2、四甲基聯苯胺TMB)，37℃顯色15 min；加入終止液(0.5 mol/L H2SO4)，用酶標儀測定波長450 nm處的OD值。

1.3.3 實驗條件的優化

為確定樣品的最佳稀釋度及二抗的最佳濃度，根據文獻[5]，使用正交實驗法優化ELISA實驗條件。樣品使用PBS進行系列稀釋，根據實驗經驗，稀釋成4個稀釋度，分別為1:50～1∶400；HRP標記的山羊抗小鼠IgG抗體也使用PBS進行系列稀釋，根據抗體說明書，稀釋為5個濃度，稀釋度為1∶2500～1:40 000，濃度分別為160 ng/mL、80 ng/mL、40 ng/mL、20 ng/mL、10 ng/mL，詳見表1。

1.3.4 方法特異性測試

使用該ELISA方法檢測實驗小鼠常見病毒的陽性血清，包括小鼠肝炎病毒、小鼠呼腸孤病毒III型、小鼠細小病毒、小鼠多瘤病毒、小鼠腺病毒、小鼠仙臺病毒、小鼠腦脊髓炎病毒、淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒的陽性血清，以及小鼠陰性血清；判斷其結果是否為陰性，從而確定該方法的特異性。

1.3.5 方法敏感性測試

使用PBS系列稀釋陽性血清，稀釋度分別為1:10、1:50、1∶100、1∶500、1∶1000、1∶5000、1:10 000、1:50 000、1∶100 000、1∶500 000、1∶1 000 000，濃度分別為6.45 mg/mL、1.29 mg/mL、645 μg/mL、129 μg/mL、64.5 μg/mL、12.9 μg/mL、6.45 μg/mL、1.29 μg/mL、645 ng/mL、129 ng/mL、64.5 ng/mL。用建立的ELISA方法進行檢測，確定其能檢測出陽性結果的最低樣品濃度，從而確定該方法的敏感性。

1.3.6 方法重復性測試

選擇本課題組制備的陽性血清樣本各3份，經3次重復檢測，每次同一樣本設3個復孔，確定檢測符合率，并計算變異系數(CV=(SD÷MN)×100%)[7]，從而確定該方法的重復性。

1.3.7 符合率檢驗

將本文建立的間接ELISA方法與美國Alpha Diagnostic International公司的間接法試劑盒Mouse Anti-Rabies IgG ELISA(貨號：600-030-MRG)比較，分析兩種方法檢測結果的一致性及符合率。

2 結果

2.1 間接ELISA法工作條件的確定

為建立該ELISA方法，使用正交實驗方法(表1)，確定檢測樣品的最佳稀釋度和二抗最佳工作濃度。根據實驗結果，隨著樣品稀釋度的提高，OD值逐漸降低；隨著二抗濃度的降低，OD值逐漸降低，符合實驗預期。按照陽性樣品OD450值>1.0，陰性結果OD450值<0.1，P/N值最大的實驗組合為最佳組合的標準[8]，我們發現該ELISA的樣品最佳稀釋度是1∶100，二抗最佳濃度為40 ng/mL，結果見表2；后續均使用該工作濃度進行實驗。

2.2 臨界值(cut-off值)的確定

2.3 方法特異性

為了解該方法是否特異，用所建立的間接ELISA方法檢測小鼠肝炎、小鼠呼腸孤病毒III型、小鼠細小病毒、小鼠多瘤病毒、小鼠腺病毒、小鼠仙臺病毒、小鼠腦脊髓炎病毒、淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒等小鼠常見病毒的陽性血清，結果均為陰性，見表3，說明該ELISA方法與上述病毒抗體無交叉反應，具有較好的特異性。

表1 正交實驗實驗設計表

表2 不同稀釋倍數血清與不同濃度二抗反應的OD450值

圖1 陰性血清間接ELISA檢測結果

2.4 方法敏感性

為了解該方法的檢測靈敏度，本研究還進行了敏感性實驗。將本科室制備的濃度為64.5 mg/mL的陽性樣品進行稀釋(1:10、1:50、1∶100、1∶500、1∶1000、1∶5000、1:10 000、1:50 000、1∶100 000、1∶500 000、1∶1 000 000)，濃度分別為6.45 mg/mL、1.29 mg/mL、645 μg/mL、129 μg/mL、64.5 μg/mL、12.9 μg/mL、6.45 μg/mL、1.29 μg/mL、645 ng/mL、129 ng/mL、64.5 ng/mL，用建立的ELISA方法進行檢測。經3次試驗，發現樣品稀釋度在1∶500時仍能檢測出陽性(見圖2)，說明該方法的最低檢測靈敏度為129 μg/mL。

表3 方法特異性實驗檢測結果

圖2 方法敏感性實驗檢測結果

表4重復性實驗結果

Table4Results of reproducibility test

樣品Samples1st2nd3rd x±sCV% x±sCV% x±sCV%10.572±0.1263.60.456±0.0449.70.430±0.0597.621.216±0.1088.91.115±0.0827.31.034±0.0615.930.903±0.1701.50.769±0.0816.10.657±0.0253.8

2.5 可重復性

為了解本研究建立方法的可重復性，選擇本科室制備的陽性血清樣本各3份，經3次檢測，每次同一樣本設3個復孔，確定檢測符合率，并計算變異系數(CV%)。結果發現，3份陽性血清樣本經重復檢測，診斷符合率為100%，變異系數為1.5%～9.7%，小于10%，見表4；說明該方法具有較好的重復性。

2.6 符合率檢驗

將本文建立的間接ELISA方法與商品化的試劑盒進行比較，分別檢測18個樣品，本文建立的方法和商品化試劑盒均檢出10例陽性，陽性率為55.56%，與樣品實際情況相符，兩者總符合率為100%。

3 討論

為研究狂犬病毒的感染及致病機制，評價狂犬疫苗及藥物的效果，動物模型是非常重要的研究工具。狂犬病毒幾乎可以感染所有的溫血脊椎動物，包括許多野生動物和常用的實驗動物，如犬、倉鼠、小鼠、豚鼠、大鼠和家兔等(其敏感性遞減)。實驗研究和病毒分離時較常應用幼齡小鼠和倉鼠，因其敏感性高，潛伏期短且恒定(5～7 d)。家兔在感染后，規律地顯現麻痹癥狀。給1日齡雛雞腦內接種狂犬病毒，可以使其發生致死性麻痹(初代街毒的潛伏期可能長達1個月左右)，連續傳代后的潛伏期縮短至6 d。地鼠也常被用于狂犬病暴露后疫苗免疫動物模型[9]。鑒于實驗小鼠的諸多優點，小鼠模型被廣泛應用于狂犬病感染及發病機制研究，以及狂犬病疫苗體內評價等工作中[10]。

了解狂犬病毒或疫苗對小鼠的免疫效果，進行狂犬病小鼠模型分析，抗體水平檢測是非常關鍵的一環。目前，檢測狂犬病抗體的有很多種，如熒光抗體中和實驗(FAVN)、小鼠中和實驗(MNT)、快速熒光灶抑制試驗(RFFIT)等[11-13]，但是這些實驗都存在著相應的缺點，如儀器需求較高、成本較高、試驗周期較長等；還需要使用狂犬病毒活毒，存在實驗室生物安全風險。為完善狂犬病小鼠模型技術體系，了解結合抗體在小鼠體內的變化規律，急需建立一種簡便易行的抗體檢測方法。國際上只有少數公司能生產類似試劑盒，但也存在貨期長、成本高等問題。

酶聯免疫吸附試驗(ELISA)只需要較短的時間(2～3 h)以及較低的成本，在定性分析上ELISA具有較大優勢。而且，ELISA與其他抗體檢測技術具有非常高的符合率。如ELISA和FAVN檢測狂犬病疫苗免疫犬血清抗體的陽性符合率為100%[14]。RFFIT、FAVN及RVNA Kit等三種方法可通用于人血清中抗狂犬病毒中和抗體的檢測，而ELISA檢測結果與中和抗體效價有一定差距，但在經過優化、校驗后ELISA也可以在有效范圍內用于狂犬病抗體的檢測[15-16]。為此，作者嘗試建立一種基于間接ELISA法檢測小鼠血清中抗狂犬病毒IgG抗體的方法，可用于狂犬病小鼠模型的分析以及疫苗效價的評估。

本研究建立的小鼠抗狂犬病毒IgG抗體ELISA檢測方法具有良好的可重復性，且特異性良好，與小鼠常見病毒無交叉反應，能在抗體濃度大于129 μg/mL時檢測出陽性結果。本實驗以商品化的試劑盒作為對照進行比較，發現二者符合率很高，符合率達到100%，證明自研試劑盒性能良好，可應用于狂犬病小鼠模型的抗體動力學追蹤分析。綜上所述，本文所建立的間接ELISA方法適于狂犬病小鼠模型的分析以及疫苗臨床前的檢測。