電子舌聯(lián)合微生物測(cè)序技術(shù)分析貯運(yùn)溫度對(duì)巴氏殺菌乳品質(zhì)的影響

丁瑞雪，耿麗娟，劉麗云，洛 雪，史海粟，武俊瑞,*

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.沈陽(yáng)市食品檢驗(yàn)所，遼寧 沈陽(yáng) 110136；3.蒙牛乳業(yè)（沈陽(yáng)）有限責(zé)任公司，遼寧 沈陽(yáng) 110100）

巴氏殺菌乳是通過(guò)低溫殺菌的一種乳品，這種殺菌方法最大限度的保留了原料乳中固有的營(yíng)養(yǎng)成分及風(fēng)味[1-2]。因此在國(guó)內(nèi)外迅速地發(fā)展起來(lái)，得到了消費(fèi)者的認(rèn)可[3-6]。巴氏殺菌乳的氣味和味道是評(píng)價(jià)其品質(zhì)的重要手段。電子舌是近年來(lái)研究的熱門話題，與傳統(tǒng)的化學(xué)分析方法相比，區(qū)別在于傳感器輸出不是樣品成分的分析結(jié)果，而是與樣品某些特征相關(guān)的信號(hào)模式，這些信號(hào)可以通過(guò)具有模式識(shí)別能力的計(jì)算機(jī)分析獲得，然后整體評(píng)估樣品的味道特征[7-10]。電子舌的應(yīng)用避免了人為感官鑒評(píng)中產(chǎn)生客觀因素的影響，利用不同的滋味傳感器能更加準(zhǔn)確地評(píng)估乳制品不同滋味的感官評(píng)分。Toko等[11]將電子舌技術(shù)應(yīng)用于牛奶分析，利用主成分分析、偏最小二乘回歸模型等分析方法驗(yàn)證了電子舌可以很好地區(qū)別不同熱處理工藝、不同貯藏時(shí)間、溫度下的牛乳[12-14]。現(xiàn)如今，已經(jīng)有很多實(shí)驗(yàn)嘗試使用電子舌分析乳制品，包括味道、風(fēng)味、新鮮度、微生物生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)等評(píng)估[15-17]。這為現(xiàn)代乳品企業(yè)和相關(guān)監(jiān)管機(jī)構(gòu)提供了新的研究思路和有效手段[18-20]。

由于巴氏殺菌乳殺菌溫度較低，冷鏈溫度并不總是保持在推薦范圍內(nèi)，由此增加了食品在儲(chǔ)存過(guò)程中變質(zhì)和潛在致病性微生物生長(zhǎng)的風(fēng)險(xiǎn)[21-22]。因而不能殺死鮮乳中全部的微生物和酶，依然存在致病菌等未消滅的菌株[23]。?awniczaka等[24]在巴氏殺菌乳門店冰箱冷藏貯存售賣期間的溫度及品質(zhì)變化的研究中一般都采用傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方式探究貯藏條件下巴氏殺菌乳微生物的變化情況。然而，隨著高通量測(cè)序技術(shù)在乳品生態(tài)位中的大量應(yīng)用，特別是那些基于16S rRNA細(xì)菌種類分類和培養(yǎng)獨(dú)立技術(shù)的工具，使得對(duì)整個(gè)微生物生態(tài)系統(tǒng)的評(píng)估更加精確[25-26]，這為探索乳制品中復(fù)雜的微生物世界提供了條件。本實(shí)驗(yàn)采用高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定了不同貯藏條件下巴氏殺菌乳微生物多樣性的變化，同時(shí)結(jié)合電子舌味感指標(biāo)更精準(zhǔn)分析、評(píng)價(jià)微生物的物種變化情況，以期為今后的研究提供更加系統(tǒng)的評(píng)價(jià)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集GZ、CG、HS三家乳業(yè)正常工藝當(dāng)天生產(chǎn)的巴氏殺菌乳制品樣品，置于冰盒中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。將采集的3 家巴氏殺菌乳混合均勻，分別置于0、4、10、15、25 ℃恒溫箱中進(jìn)行貯藏，并分別于0、3、6、9、12、15 d進(jìn)行取樣，備用進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器與設(shè)備

InsentSA402B電子舌 日本Insent公司；YCDEL259醫(yī)用冷藏冷凍箱 中科美菱低溫科技股份有限公司；HN-50S電熱恒溫培養(yǎng)箱 邦西儀器科技（上海）有限公司；MIR-254-PC低溫恒溫培養(yǎng)箱 日本松下健康醫(yī)療器械公司；Axy Prep DNA凝膠回收試劑盒AXYGEN公司；TGL-168高速臺(tái)式離心機(jī)、超低溫冰箱、微量紫外-分光光度計(jì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增儀德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 乳業(yè)的工藝條件

GZ乳業(yè)的工藝條件：原奶驗(yàn)收→凈乳→預(yù)巴殺→冷藏→定容檢驗(yàn)→預(yù)熱均質(zhì)→巴氏殺菌→冷藏罐裝→成品。

CG乳業(yè)的工藝條件：原奶驗(yàn)收→凈乳→均質(zhì)→巴氏殺菌→降溫罐裝→成品。

HS乳業(yè)的工藝條件：原料乳的驗(yàn)收→過(guò)濾與凈化→標(biāo)準(zhǔn)化→均質(zhì)→巴氏殺菌→冷卻灌裝→成品。

1.3.2 感官評(píng)價(jià)

根據(jù)RHB 101—2004《巴氏殺菌乳感官質(zhì)量評(píng)鑒細(xì)則》[27]中巴氏殺菌乳的感官質(zhì)量評(píng)鑒細(xì)則，選用20 位以乳制品專業(yè)為基礎(chǔ)，經(jīng)過(guò)感官分析培訓(xùn)的女性評(píng)審員（29～59 歲）[28]進(jìn)行對(duì)于巴氏殺菌乳的滋氣味、組織狀態(tài)和色澤進(jìn)行感官評(píng)鑒。用于感官評(píng)鑒的牛奶樣品在環(huán)境溫度20 ℃統(tǒng)一呈送[28]，每種樣品的各個(gè)參數(shù)重復(fù)品評(píng)2 次，結(jié)果取平均值，作為判定結(jié)果。

1.3.3 電子舌檢測(cè)及味感測(cè)定方法

電子舌的檢測(cè)參數(shù)為：最大電位1.00 V、最小電位-1.00 V、點(diǎn)位步進(jìn)0.2 V、電極靈敏度0.000 1。取適量體積的巴氏殺菌乳于專用小杯中，電子舌的傳感器在各個(gè)樣品中的采集測(cè)量30 s，清潔330 s。每種樣品測(cè)量5 次。電子舌利用電化學(xué)傳感器通過(guò)測(cè)定液體樣本的綜合味覺(jué)信息，從而對(duì)被測(cè)試樣進(jìn)行定量和定性分析。

1.3.4 巴氏殺菌乳中細(xì)菌種類的測(cè)定方法

取不同貯藏條件下的樣品10 mL放入離心管中，離心后去除乳脂層，再次離心后收集沉淀按照DNA試劑盒要求進(jìn)行提取并利用16S rRNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，本實(shí)驗(yàn)中的每個(gè)樣本擴(kuò)增3 份，按物質(zhì)的量比例混合后在MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

1.4.1 感官評(píng)價(jià)的數(shù)據(jù)分析方法

繪制雷達(dá)圖，分析比較巴氏殺菌乳在不同貯藏條件下的感官特性。評(píng)價(jià)特性及指標(biāo)見(jiàn)表1。

表1 巴氏殺菌乳感官評(píng)分[27]Table 1 Criteria for sensory evaluation of pasteurized milk

1.4.2 電子鼻和電子舌的數(shù)據(jù)分析方法

利用電子舌對(duì)不同貯藏條件下的各樣品進(jìn)行酸、苦、澀、甜、咸和鮮6 個(gè)值的測(cè)試，并且各樣品平行測(cè)定3 次，繪制雷達(dá)圖用于主成分分析。

1.4.3 巴氏殺菌乳中細(xì)菌種類的分析方法

在97%的相似性水平上歸類和確定分類單位數(shù)量，同時(shí)結(jié)合電子舌檢測(cè)結(jié)果確定巴氏殺菌乳在不同貯藏條件下的細(xì)菌種類變化情況。使用QIIME（quantitative insights into microbial ecology）軟件去除低質(zhì)量序列，做成熱圖，再進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評(píng)價(jià)分析

圖1為巴氏殺菌乳樣品感官特性的描述性檢驗(yàn)得分雷達(dá)圖。分析不同貯藏條件下巴氏殺菌乳滋氣味、組織狀態(tài)、色澤評(píng)分的變化。

圖1 不同貯藏條件下巴氏殺菌乳感官特性雷達(dá)圖Fig. 1 Radar diagram of sensory characteristics of pasteurized milk under different storage conditions

由圖1可知，隨著貯藏溫度升高、時(shí)間延長(zhǎng)，巴氏殺菌乳滋氣味的評(píng)分呈趨勢(shì)性的下降。巴氏殺菌乳在0、4、10 ℃貯藏時(shí)其滋氣味評(píng)分下降緩慢，在3 d內(nèi)都能保持有乳香味。而巴氏殺菌乳的組織狀態(tài)同樣在0、4、10 ℃貯藏下時(shí)無(wú)明顯下降趨勢(shì)，證明此溫度下無(wú)沉淀和脂肪分離的情況。而從15 ℃開(kāi)始，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，下降趨勢(shì)愈加顯著。相同的，巴氏殺菌乳在低溫貯藏條件下普遍呈現(xiàn)乳白色，隨著溫度的升高，逐步達(dá)到黃褐色，此變化或許與其出現(xiàn)黏稠的組織狀態(tài)有關(guān)。

2.2 電子舌評(píng)價(jià)分析

由圖2可知，不同貯藏溫度、時(shí)間下的巴氏殺菌乳的各個(gè)味感值有明顯的變化。0 ℃貯藏不同時(shí)間各味感變化最為明顯。而巴氏殺菌乳在其他貯藏溫度條件下，隨著貯藏溫度升高和、時(shí)間的延長(zhǎng)，鮮味及苦味值發(fā)生略微的下降，而其澀味值則有輕微的上升現(xiàn)象。巴氏殺菌乳在貯藏過(guò)程中其特有的香甜味是主要變化指標(biāo)，因此，巴氏殺菌乳在15、25 ℃條件貯藏后都會(huì)導(dǎo)致甜味的顯著下降。而隨著貯藏溫度及時(shí)間的增加，可能微生物的生長(zhǎng)也導(dǎo)致了巴氏殺菌乳的發(fā)酵腐敗，使其酸味值顯著上升。

圖2 貯藏在0（A）、4（B）、10（C）、15（D）、25 ℃（E）巴氏殺菌乳電子舌雷達(dá)圖Fig. 2 Radar maps of electronic tongue responses to pasteurized milk samples stored at 0 (A), 4 (B), 10 (C), 15 (D) and 25 ℃ (E)

2.3 巴氏殺菌乳電子舌味感與細(xì)菌多樣性主成分分析

圖3 巴氏殺菌乳電子舌味感與其屬水平上細(xì)菌多樣性主成分分析Fig. 3 Principal component analysis of electronic tongue taste and bacterial diversity of pasteurized milk

如圖3可知，圖中主成分1、主成分2保留了78.73%的原始數(shù)據(jù)信息。以上不同顏色標(biāo)記是基于不同溫度劃分的5 組組分，兩樣本點(diǎn)越接近，表明兩樣本物種組成越相似。不同樣品之間微生物多樣性的差異可以通過(guò)圖中各樣本點(diǎn)的距離表征，兩樣本點(diǎn)相聚越近證明其微生物多樣性越相似。同時(shí)，電子舌味感的數(shù)量型會(huì)被顯示成向量，樣本點(diǎn)到數(shù)量型電子舌味感向量的投影距離表示樣本受該環(huán)境因子影響大小。研究發(fā)現(xiàn)，屬水平上的各樣品到向量1酸味、向量2澀味味感投影距離接近于0或?yàn)樨?fù)值。這表明巴氏殺菌乳樣品中的微生物組成與酸、澀兩種味感的相關(guān)性較小。而其他樣品到向量3苦味、向量4咸味、向量5鮮味、向量6甜味味感的投影距離大多為正值，因此猜測(cè)其與乳中細(xì)菌多樣性密切相關(guān)。相關(guān)研究也表明，某些微生物屬水平物種皆對(duì)苦味呈現(xiàn)著顯著的正相關(guān)性[29]。同時(shí)，Wei Zhenbo等[30]研究也發(fā)現(xiàn)，在貯藏過(guò)程中，牛奶樣品的理化性質(zhì)在主成分分析圖中也表現(xiàn)出類似的規(guī)律性。

2.4 巴氏殺菌乳電子舌味感與細(xì)菌多樣性相關(guān)性熱圖分析

如圖4所示，巴氏殺菌乳電子舌味感與細(xì)菌多樣性密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，各細(xì)菌菌屬對(duì)鮮味味感的影響最小，氣單胞菌屬（Aeromonas）、阪崎腸桿菌（Cronobacter）、沙雷氏菌（Serratia）、梭狀芽孢桿菌（Costridium）甚至與其呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。同樣的，上述物種菌屬也都對(duì)巴氏殺菌乳的苦味、咸味、甜味有著負(fù)相關(guān)性。有研究表明，某些孢子形成細(xì)菌在冷藏條件下生長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致蛋白水解酶對(duì)牛奶種的主要成分進(jìn)行分解，從而影響其感官質(zhì)量[29]。并且，除氣單胞菌屬、梭狀芽孢桿菌、沙雷氏菌、類芽孢桿菌（Paenibacillus）、假單胞菌（Pseudomonas）外，其他屬水平物種皆對(duì)苦味呈現(xiàn)著顯著的正相關(guān)性，這些菌屬可能會(huì)是致使乳品發(fā)生腐敗變質(zhì)的關(guān)鍵因素。相關(guān)研究也證實(shí)了，即使這種能力只存在于某些屬/種，包括類芽孢桿菌、綠芽孢桿菌屬（Viridibacillus spp.）[31]，但這些菌株依然是牛奶在冷藏條件下變質(zhì)的主要原因。

圖4 巴氏殺菌乳電子舌味感與細(xì)菌多樣性相關(guān)性熱圖分析Fig. 4 Heatmap analysis of the relationship between electronic tongue taste and bacterial diversity in pasteurized milk

3 討 論

使用電子舌技術(shù)對(duì)乳制品樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與人類味覺(jué)相比，味覺(jué)傳感器具有更高的靈敏度。三點(diǎn)檢驗(yàn)法品評(píng)出來(lái)的正確區(qū)分人數(shù)作為食品整體品質(zhì)指標(biāo)，結(jié)合Arrhenius動(dòng)力學(xué)方程確定了鮮牛奶、豆奶的貨架期預(yù)測(cè)模型并進(jìn)行貨架期預(yù)測(cè)。發(fā)現(xiàn)基于電子舌差別度方法預(yù)測(cè)的豆奶感官貨架期偏差較大，比實(shí)際值高，但預(yù)測(cè)出的微生物貨架期卻比微生物方法的預(yù)測(cè)結(jié)果更為精確[32]。Yoshida等[33]利用味覺(jué)傳感器客觀地測(cè)定了24 位健康母親和14 位乳腺炎母親的乳汁的4 種基本味道——酸味、咸味、苦味和鮮味。研究發(fā)現(xiàn)，初乳向成熟牛奶的轉(zhuǎn)變伴隨著牛奶味道的變化，如咸味和鮮味降低，苦味和酸味增加。在這種情況下，由于鈉、谷氨酸鹽和磷酸鳥(niǎo)苷的含量增加，牛奶中鮮味和咸味增加最終導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)，不同貯藏溫度、時(shí)間下的巴氏殺菌乳均具有苦、咸、甜味及鮮味，酸味、澀味微弱，通過(guò)對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著貯藏溫度升高和時(shí)間增加，巴氏殺菌乳的咸、鮮、澀及苦味有明顯的變化。

同時(shí)，Mizota等[34]也對(duì)牛奶的味道進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在牛奶均質(zhì)過(guò)程中能夠檢測(cè)到細(xì)微的微生物變化[35]。在牛奶儲(chǔ)存過(guò)程中，除了微生物的生長(zhǎng)以外，使用偏最小二乘法和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)牛奶樣品中的細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程也提供了令人滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[36]。在貯藏過(guò)程中，對(duì)牛奶樣品的細(xì)菌總數(shù)、酸度和黏度進(jìn)行了測(cè)定，其理化性質(zhì)在主成分分析圖中表現(xiàn)出規(guī)律性。結(jié)果表明，該方法可用于監(jiān)測(cè)未密封巴氏滅菌奶的質(zhì)量?jī)?chǔ)存時(shí)間[30]。相關(guān)研究結(jié)果表明，未封口的巴氏殺菌奶樣品在-4 ℃存儲(chǔ)后，利用電子舌法能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)牛奶樣品種的細(xì)菌總數(shù)和黏度[37]。例如，一些腐敗微生物（如假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬等）能夠破壞乳品的品質(zhì)條件，從而對(duì)乳品企業(yè)的售賣帶來(lái)明顯的經(jīng)濟(jì)損失[38]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，與乳制品行業(yè)相關(guān)的孢子形成菌（蠟樣芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌）[39]，是作為奶粉質(zhì)量檢測(cè)的重要指標(biāo)（嗜熱菌）[40]，其可能會(huì)限制液態(tài)奶的保質(zhì)期[30]。因此，微生物群落的組成取決于乳制品中存在的微生物及其儲(chǔ)存條件所帶來(lái)的影響[41-42]。本實(shí)驗(yàn)采用電子舌對(duì)于不同貯藏條件下的巴氏殺菌乳進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，研究分析鮮、咸、澀味下降的原因，這可能與巴氏殺菌乳中微生物的大量繁殖造成其品質(zhì)腐敗有關(guān)，高通量測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)在貯藏期間含有氣單胞菌、芽孢桿菌、沙雷氏菌、類芽孢桿菌、假單胞菌等菌屬的存在，它們直接或間接影響著巴氏殺菌乳的味感及品質(zhì)。同時(shí)，由大量數(shù)據(jù)分析結(jié)果也驗(yàn)證了電子舌儀器的穩(wěn)定性及各傳感器的分辨能力。將電子舌技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)不同新鮮度、不同熱處理來(lái)源的乳制品，再通過(guò)微生物、理化等方面結(jié)合能夠更好地探究乳制品中更為復(fù)雜的微生物世界提供了條件。