乳扇中高產(chǎn)胞外多糖酵母菌的篩選及其抗氧化活性

趙英杰，張文平，吳劍梅，程 新*

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045）

胞外多糖是微生物在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外，易與菌體分離的水溶性大分子糖類物質(zhì)，屬于微生物的次級代謝產(chǎn)物，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[1-2]。目前國內(nèi)外對產(chǎn)胞外多糖微生物研究主要集中在大型真菌和細(xì)菌[3-4]，而酵母菌多糖由于產(chǎn)量低、代謝途徑相對復(fù)雜等原因，對其研究相對較少[5]?，F(xiàn)有研究表明，畢赤酵母、膠紅酵母、假絲酵母、隱球酵母等菌株都能合成胞外多糖[5]，而且酵母菌胞外多糖在調(diào)節(jié)免疫力[6]、抗腫瘤[7]、抗病毒[8]、抗氧化[9]、抗疲勞[6]、止痛[10]等方面均有較好的生物學(xué)活性，同時還可以提高其他多糖的黏度和強(qiáng)度[11-12]，在食品、醫(yī)藥及化妝品生產(chǎn)等領(lǐng)域有著較好的應(yīng)用前景。

長期以來，從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選高產(chǎn)胞外多糖的微生物一直是研究的熱點領(lǐng)域[13-14]。乳扇是主要產(chǎn)于云南大理的一種傳統(tǒng)乳制品，它以新鮮牛奶為原料，采用自然發(fā)酵酸乳清為凝乳劑，經(jīng)過一系列加工而成[15]，具有鮮明的地方特征和民族特色，含有豐富的微生物資源[16-17]。目前已有研究人員開展了乳扇中乳酸菌資源的篩選工作[18]，但對于乳扇中酵母菌的分離及其功能特性的相關(guān)研究還鮮見報道。本研究從乳扇中分離產(chǎn)胞外多糖酵母菌并進(jìn)行鑒定，進(jìn)而對其生長特性、產(chǎn)糖能力、代謝特征及抗氧化能力進(jìn)行測定，為進(jìn)一步豐富產(chǎn)胞外多糖菌株微生物資源提供一定的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳扇購于云南大理白族自治州賓川縣，置于4 ℃冰箱中保藏備用；酵母DNA提取試劑盒（Omega Yeast DNA Kit）。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、蛋白胨20 g、酵母浸粉10 g、蒸餾水1 000 mL；基礎(chǔ)產(chǎn)糖培養(yǎng)基：葡萄糖50 g、硫酸銨2 g、磷酸二氫鉀1 g、酵母浸粉1 g、氯化鈣0.1 g、吐溫-80 1 mL、蒸餾水1 000 mL，pH 6.0；生理生化鑒定用培養(yǎng)基：糖發(fā)酵培養(yǎng)基、同化碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基、同化氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基；以上培養(yǎng)基均在100 kPa、121 ℃高壓滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

JW-3022HR高速冷凍離心機(jī) 安徽嘉文儀器裝備有限公司；LXJ-IIB低速大容量多管離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；721可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；LRH-250-C培養(yǎng)箱 韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；LT1002B電子天平 常熟市天量儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)胞外多糖酵母菌的分離和篩選

稱取乳扇樣品2 g，加入至含有100 mL無菌水的三角瓶中振蕩10 min，無菌條件下用無菌水稀釋，選取10-3、10-4、10-5、10-6四個濃度梯度的乳扇樣品菌懸液在YEPD平板培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布分離，28 ℃培養(yǎng)48 h后挑取具有典型酵母菌落特征的單菌落鏡檢，選擇具有酵母菌特征的菌落進(jìn)一步劃線分離純化，重復(fù)幾次后將得到的單菌落挑至斜面培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)48 h后于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹19]。

分別將初篩保藏的酵母菌挑取1 環(huán)到種子培養(yǎng)基中，180 r/min、28 ℃培養(yǎng)24 h，將種子液按2%的接種量接種到基礎(chǔ)產(chǎn)糖培養(yǎng)基中，180 r/min、28 ℃發(fā)酵48 h后[20]，將發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min，取適量上清液用三氯乙酸法除蛋白，離心棄去蛋白沉淀后，小心吸取上清液加入3 倍體積的無水乙醇，于4 ℃冰箱中靜置過夜，離心所得沉淀用適量蒸餾水溶解[21]，用苯酚-硫酸法測定胞外多糖的產(chǎn)量。根據(jù)初篩的結(jié)果，挑選數(shù)株產(chǎn)胞外多糖的酵母菌進(jìn)入復(fù)篩，實驗方法同初篩。

1.3.2 產(chǎn)胞外多糖酵母菌株的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

1.3.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

用接種環(huán)取1 環(huán)液體培養(yǎng)物，劃線于YEPD平板，于28 ℃培養(yǎng)，每天觀察一次，記錄以下特征：顏色、光澤、表面光滑或皺褶、菌落隆起程度、菌落邊緣形狀并獲取圖片[22]。個體形態(tài)觀察：用接種環(huán)在生長于培養(yǎng)基上的菌落挑取少許菌量進(jìn)行制片，在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察[23]。

1.3.2.2 生理生化鑒定

對酵母菌進(jìn)行碳源同化實驗、氮源同化實驗、糖發(fā)酵實驗、產(chǎn)酸實驗[24]，并參照文獻(xiàn)[25]對比鑒定判斷。

1.3.2.3 分子生物學(xué)鑒定

用酵母DNA提取試劑盒，提取菌株的總DNA。用引物NL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）和NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）擴(kuò)增，并進(jìn)行電泳[26]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序（ABI3730），并利用ContigExpress拼接程序進(jìn)行拼接。引物對合成及PCR產(chǎn)物測序由上海美吉生物科技有限公司完成，序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對分析，鑒定種屬信息。根據(jù)序列利用MEGA6.0軟件建立系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)化樹拓?fù)浞治鰹? 000 個重復(fù)取樣的結(jié)果[27]。

1.3.3 產(chǎn)胞外多糖酵母菌的生長曲線及發(fā)酵產(chǎn)糖特性

從保存的酵母菌斜面挑取1 環(huán)接種至種子液培養(yǎng)基，180 r/min、28 ℃培養(yǎng)24 h，此為種子液。按2%接種量將種子液接種至基礎(chǔ)產(chǎn)糖培養(yǎng)基，180 r/min、28 ℃發(fā)酵168 h，定時取樣，測定其生物量（OD600nm）、pH值及胞外多糖產(chǎn)量。

1.3.4 碳源對酵母菌產(chǎn)胞外多糖的影響

以發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中的葡萄糖用等質(zhì)量的蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖、糖蜜代替，接入2%的種子液，180 r/min、28 ℃發(fā)酵168 h，按1.3.1節(jié)方法提取測定胞外多糖的產(chǎn)量。

1.3.5 高產(chǎn)胞外多糖菌株胞外多糖的體外抗氧化活性測定

參照已有研究方法對胞外多糖1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力[28-29]、羥自由基清除能力[10]、超氧陰離子自由基清除能力[10]及還原力[30]進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個實驗重復(fù)3 次，圖形繪制采用Origin 8.1軟件，數(shù)據(jù)處理采用DPS 7.5 軟件；對不同處理數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，多重比較采用Duncan法。P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)胞外多糖菌株的篩選

通過多次平板劃線分離，共得到38 株具有典型酵母菌形態(tài)的微生物，對其進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)糖測定。實驗結(jié)果表明，共有9 株酵母菌產(chǎn)胞外多糖能力較好，如圖1所示，其中12號產(chǎn)量較高，發(fā)酵48 h后胞外多糖產(chǎn)量可達(dá)1 024.92 mg/L。

圖1 9 株酵母菌的胞外多糖產(chǎn)量Fig. 1 EPS Production of 9 strains of yeast

2.2 產(chǎn)胞外多糖菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

將具有產(chǎn)胞外多糖能力的酵母菌在平板上培養(yǎng)后，進(jìn)行菌落形態(tài)及個體形態(tài)觀察。各菌株的菌落形態(tài)、個體形態(tài)如表1及圖2所示。9 株酵母菌在平板培養(yǎng)6 d后，1～3號均為粉紅色，9號為乳黃色，12號為淺黃色，其余均為白色，且所有酵母菌落均為邊緣整齊的圓形，表面光滑，質(zhì)地黏稠，不透明，有光澤，凸起，且菌落直徑較大；在顯微鏡下觀察，6、9號和12號細(xì)胞形態(tài)為橢圓，其余菌株均為圓形。

表1 分離酵母的菌落形態(tài)和個體形態(tài)描述Table 1 Description of colonial and cellular morphology of isolated yeast strains

圖2 酵母菌的個體形態(tài)及菌落形態(tài)（×400）Fig. 2 Cellular and colony morphology of yeast (× 400)

2.2.2 產(chǎn)胞外多糖酵母菌的生理生化鑒定

表2 酵母菌碳、氮同化鑒定結(jié)果Table 2 Carbon and nitrogen assimilation of yeast

表3 糖發(fā)酵及產(chǎn)酸鑒定結(jié)果Table 3 Sugar fermentation and acid production abilities

純化酵母菌的碳、氮源同化能力測定如表2所示。所有菌株均能同化選用的碳源及酵母浸粉，均不能同化尿素，5號菌株不能同化硫酸銨、硝酸鉀和硝酸銨，6號菌株不能同化硫酸銨。如表3所示，在實驗所采用的糖類范圍內(nèi)，所有菌株均不能發(fā)酵產(chǎn)氣，同時除4號菌株外均不能利用糖發(fā)酵產(chǎn)酸。9 株酵母菌都未發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵產(chǎn)乙醇，都無令人愉快的酯香。

2.3 篩選所得菌株的分子生物學(xué)鑒定

將篩選到的菌株進(jìn)行2 6 S r D N A測序，利用MEGA 6.0軟件，進(jìn)行多序列同源性比對，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果如圖3所示，1～3號菌株為膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）；4號菌株為白假絲酵母（Candida albicans）；5～7、9號菌株為涎沫假絲酵母（Candida zeylanoides）；12號菌株為金黃蝶形擔(dān)孢酵母（Papiliotrema aurea），又名金黃色隱球酵母（Cryptococcus aureus）[31-32]。

圖3 基于26S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on 26S rRNA gene sequences

2.4 產(chǎn)胞外多糖酵母菌的生長曲線及發(fā)酵特性

圖4 酵母菌發(fā)酵過程中生物量、pH值及胞外多糖產(chǎn)量的變化Fig. 4 Biomass, pH and EPS production during yeast fermentation

由圖4可知，9 株酵母的生物量均在發(fā)酵前期迅速增加，pH值迅速降低，而胞外多糖在發(fā)酵中期開始積累，發(fā)酵后期達(dá)到最大。根據(jù)研究表明，菌體生長與胞外多糖的合成為部分偶聯(lián)型[33]，胞外多糖可能為酵母菌的次級代謝產(chǎn)物[34]，因此在提高酵母菌胞外多糖產(chǎn)量時，必須同時考慮其生長特性。

在發(fā)酵168 h時，12號的胞外多糖的產(chǎn)量最高，可達(dá)3 510.69 mg/L，2號菌株也較高，產(chǎn)量為2 384.03 mg/L，其余菌株產(chǎn)量較低，介于800～1 500 mg/L之間。孫曉萌等[35]從海參腸篩選出1 株假絲酵母，胞外多糖產(chǎn)量為137 mg/L；高鵬等[19]從海參腸篩選出1 株假絲酵母，優(yōu)化后胞外多糖產(chǎn)量為762 mg/L；包怡紅等[20]從自然界中篩選出1 株東方伊薩酵母，經(jīng)優(yōu)化后胞外多糖產(chǎn)量為2 046 mg/L；Pavlova等[36]從南極分離出4 株產(chǎn)糖酵母，在以葡萄糖或蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中胞外多糖產(chǎn)量分別可達(dá)1 750～2 630 mg/L及2 120～3 040 mg/L。與上述研究相比，本研究分離得到的酵母菌胞外多糖產(chǎn)量相對較高，具有較好的工業(yè)化生產(chǎn)潛力，因此最終選定高產(chǎn)胞外多糖的菌株12號菌株進(jìn)行后續(xù)實驗，并將其命名為DF-12。

2.5 碳源對DF-12胞外多糖產(chǎn)量的影響

圖5 碳源對DF-12胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig. 5 Effects of carbon sources on EPS production of DF-12

碳源是影響微生物發(fā)酵合成多糖最為重要的營養(yǎng)因子，胞外多糖產(chǎn)量與所采用的碳源種類直接有關(guān)，且微生物在不同碳源培養(yǎng)基中合成的胞外多糖具有不同的理化性質(zhì)[37]，直接影響其應(yīng)用效果。如圖5所示，當(dāng)采用葡萄糖或蔗糖為碳源時，胞外多糖產(chǎn)量較高，可達(dá)3 250～3 500 mg/L；碳源為其他實驗糖類時，胞外多糖產(chǎn)量僅為1 500～2 500 mg/L，說明培養(yǎng)基中碳源種類對胞外多糖產(chǎn)量有較大影響。除此以外，DF-12也能利用制糖工業(yè)副產(chǎn)物糖蜜合成胞外多糖，產(chǎn)量僅略低于葡萄糖、蔗糖及果糖，在可見該菌株具有工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的潛力。

2.6 DF-12的胞外多糖體外抗氧化活性

圖6 DF-12胞外多糖對羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基的清除率及還原力Fig. 6 Scavenging capacity against hydroxyl, superoxide anion and DPPH radicals as well as reducing power of EPS produced by DF-12

過量的自由基能夠損害生物膜，破壞細(xì)胞氧化蛋白質(zhì)和脂肪，損傷DNA，從而引起諸多疾病[38]?，F(xiàn)有研究表明，酵母菌的胞外多糖具有較強(qiáng)的體外抗氧化能力，對羥自由基[10,29]、DPPH自由基[39]、超氧陰離子自由基[39]有較強(qiáng)的清除能力和還原力[40]。本研究以VC作為陽性對照，測定DF-12胞外多糖活性。由圖6可知，在較低質(zhì)量濃度時，VC對超氧陰離子自由基和DPPH自由基有較強(qiáng)的清除效果，而對羥自由基的清除率與質(zhì)量濃度表現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。綜合來看，酵母菌胞外多糖對羥自由基、DPPH自由基的清除率及還原力均隨質(zhì)量濃度增加而增大，在質(zhì)量濃度高于6 mg/mL時還原力甚至高于同等濃度的VC，但對羥自由基清除率較低。該實驗表明DF-12胞外多糖具有良好的體外抗氧化活性，具備開發(fā)為食品或藥品的潛力。

3 結(jié) 論

本研究以云南傳統(tǒng)乳制品乳扇為材料，從中分離篩選出9 株產(chǎn)胞外多糖的酵母菌并進(jìn)行鑒定，其中1 株金黃蝶形擔(dān)孢酵母，又名金黃色隱球酵母，具有較好的胞外多糖合成能力，在以葡萄糖和蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中胞外多糖產(chǎn)量可達(dá)3 510 mg/L左右，高于目前所報道的絕大多數(shù)酵母菌株，且其所合成的胞外多糖具有較好的抗氧化能力。碳源實驗表明所得菌株具備利用糖蜜產(chǎn)胞外多糖的能力，且產(chǎn)量高于現(xiàn)有類似報道[41]，展示出其在工業(yè)化生產(chǎn)中的巨大潛力。此外，近年來對酵母菌胞外多糖的研究大多集中于為釀酒酵母、膠紅酵母、黏質(zhì)紅酵母、白假絲酵母、畢赤酵母等[5]，而本研究報道了金黃蝶形擔(dān)孢酵母具備高產(chǎn)胞外多糖的能力，為開發(fā)產(chǎn)胞外多糖的酵母菌資源提供了新的思路。