乳扇中高產胞外多糖酵母菌的篩選及其抗氧化活性

趙英杰，張文平，吳劍梅，程 新*

（江西農業大學生物科學與工程學院，江西 南昌 330045）

胞外多糖是微生物在生長代謝過程中分泌到細胞壁外，易與菌體分離的水溶性大分子糖類物質，屬于微生物的次級代謝產物，在食品、醫藥等領域有廣泛的應用[1-2]。目前國內外對產胞外多糖微生物研究主要集中在大型真菌和細菌[3-4]，而酵母菌多糖由于產量低、代謝途徑相對復雜等原因，對其研究相對較少[5]。現有研究表明，畢赤酵母、膠紅酵母、假絲酵母、隱球酵母等菌株都能合成胞外多糖[5]，而且酵母菌胞外多糖在調節免疫力[6]、抗腫瘤[7]、抗病毒[8]、抗氧化[9]、抗疲勞[6]、止痛[10]等方面均有較好的生物學活性，同時還可以提高其他多糖的黏度和強度[11-12]，在食品、醫藥及化妝品生產等領域有著較好的應用前景。

長期以來，從傳統發酵食品中篩選高產胞外多糖的微生物一直是研究的熱點領域[13-14]。乳扇是主要產于云南大理的一種傳統乳制品，它以新鮮牛奶為原料，采用自然發酵酸乳清為凝乳劑，經過一系列加工而成[15]，具有鮮明的地方特征和民族特色，含有豐富的微生物資源[16-17]。目前已有研究人員開展了乳扇中乳酸菌資源的篩選工作[18]，但對于乳扇中酵母菌的分離及其功能特性的相關研究還鮮見報道。本研究從乳扇中分離產胞外多糖酵母菌并進行鑒定，進而對其生長特性、產糖能力、代謝特征及抗氧化能力進行測定，為進一步豐富產胞外多糖菌株微生物資源提供一定的理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳扇購于云南大理白族自治州賓川縣，置于4 ℃冰箱中保藏備用；酵母DNA提取試劑盒（Omega Yeast DNA Kit）。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基：葡萄糖20 g、蛋白胨20 g、酵母浸粉10 g、蒸餾水1 000 mL；基礎產糖培養基：葡萄糖50 g、硫酸銨2 g、磷酸二氫鉀1 g、酵母浸粉1 g、氯化鈣0.1 g、吐溫-80 1 mL、蒸餾水1 000 mL，pH 6.0；生理生化鑒定用培養基：糖發酵培養基、同化碳源基礎培養基、同化氮源基礎培養基；以上培養基均在100 kPa、121 ℃高壓滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

JW-3022HR高速冷凍離心機 安徽嘉文儀器裝備有限公司；LXJ-IIB低速大容量多管離心機 上海安亭科學儀器廠；721可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；LRH-250-C培養箱 韶關市泰宏醫療器械有限公司；LT1002B電子天平 常熟市天量儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 產胞外多糖酵母菌的分離和篩選

稱取乳扇樣品2 g，加入至含有100 mL無菌水的三角瓶中振蕩10 min，無菌條件下用無菌水稀釋，選取10-3、10-4、10-5、10-6四個濃度梯度的乳扇樣品菌懸液在YEPD平板培養基上進行涂布分離，28 ℃培養48 h后挑取具有典型酵母菌落特征的單菌落鏡檢，選擇具有酵母菌特征的菌落進一步劃線分離純化，重復幾次后將得到的單菌落挑至斜面培養基，28 ℃培養48 h后于4 ℃冰箱中保存備用[19]。

分別將初篩保藏的酵母菌挑取1 環到種子培養基中，180 r/min、28 ℃培養24 h，將種子液按2%的接種量接種到基礎產糖培養基中，180 r/min、28 ℃發酵48 h后[20]，將發酵液10 000 r/min離心10 min，取適量上清液用三氯乙酸法除蛋白，離心棄去蛋白沉淀后，小心吸取上清液加入3 倍體積的無水乙醇，于4 ℃冰箱中靜置過夜，離心所得沉淀用適量蒸餾水溶解[21]，用苯酚-硫酸法測定胞外多糖的產量。根據初篩的結果，挑選數株產胞外多糖的酵母菌進入復篩，實驗方法同初篩。

1.3.2 產胞外多糖酵母菌株的鑒定及系統發育樹的構建

1.3.2.1 形態學鑒定

用接種環取1 環液體培養物，劃線于YEPD平板，于28 ℃培養，每天觀察一次，記錄以下特征：顏色、光澤、表面光滑或皺褶、菌落隆起程度、菌落邊緣形狀并獲取圖片[22]。個體形態觀察：用接種環在生長于培養基上的菌落挑取少許菌量進行制片，在普通光學顯微鏡下進行觀察[23]。

1.3.2.2 生理生化鑒定

對酵母菌進行碳源同化實驗、氮源同化實驗、糖發酵實驗、產酸實驗[24]，并參照文獻[25]對比鑒定判斷。

1.3.2.3 分子生物學鑒定

用酵母DNA提取試劑盒，提取菌株的總DNA。用引物NL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）和NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）擴增，并進行電泳[26]。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增產物進行Sanger測序（ABI3730），并利用ContigExpress拼接程序進行拼接。引物對合成及PCR產物測序由上海美吉生物科技有限公司完成，序列提交NCBI數據庫進行BLAST比對分析，鑒定種屬信息。根據序列利用MEGA6.0軟件建立系統進化樹，進化樹拓撲分析為1 000 個重復取樣的結果[27]。

1.3.3 產胞外多糖酵母菌的生長曲線及發酵產糖特性

從保存的酵母菌斜面挑取1 環接種至種子液培養基，180 r/min、28 ℃培養24 h，此為種子液。按2%接種量將種子液接種至基礎產糖培養基，180 r/min、28 ℃發酵168 h，定時取樣，測定其生物量（OD600nm）、pH值及胞外多糖產量。

1.3.4 碳源對酵母菌產胞外多糖的影響

以發酵產糖培養基為基礎培養基，其中的葡萄糖用等質量的蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖、糖蜜代替，接入2%的種子液，180 r/min、28 ℃發酵168 h，按1.3.1節方法提取測定胞外多糖的產量。

1.3.5 高產胞外多糖菌株胞外多糖的體外抗氧化活性測定

參照已有研究方法對胞外多糖1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力[28-29]、羥自由基清除能力[10]、超氧陰離子自由基清除能力[10]及還原力[30]進行測定。

1.4 數據處理

每個實驗重復3 次，圖形繪制采用Origin 8.1軟件，數據處理采用DPS 7.5 軟件；對不同處理數據比較采用單因素方差分析，多重比較采用Duncan法。P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 產胞外多糖菌株的篩選

通過多次平板劃線分離，共得到38 株具有典型酵母菌形態的微生物，對其進行發酵產糖測定。實驗結果表明，共有9 株酵母菌產胞外多糖能力較好，如圖1所示，其中12號產量較高，發酵48 h后胞外多糖產量可達1 024.92 mg/L。

圖1 9 株酵母菌的胞外多糖產量Fig. 1 EPS Production of 9 strains of yeast

2.2 產胞外多糖菌株的鑒定

2.2.1 形態學觀察

將具有產胞外多糖能力的酵母菌在平板上培養后，進行菌落形態及個體形態觀察。各菌株的菌落形態、個體形態如表1及圖2所示。9 株酵母菌在平板培養6 d后，1～3號均為粉紅色，9號為乳黃色，12號為淺黃色，其余均為白色，且所有酵母菌落均為邊緣整齊的圓形，表面光滑，質地黏稠，不透明，有光澤，凸起，且菌落直徑較大；在顯微鏡下觀察，6、9號和12號細胞形態為橢圓，其余菌株均為圓形。

表1 分離酵母的菌落形態和個體形態描述Table 1 Description of colonial and cellular morphology of isolated yeast strains

圖2 酵母菌的個體形態及菌落形態（×400）Fig. 2 Cellular and colony morphology of yeast (× 400)

2.2.2 產胞外多糖酵母菌的生理生化鑒定

表2 酵母菌碳、氮同化鑒定結果Table 2 Carbon and nitrogen assimilation of yeast

表3 糖發酵及產酸鑒定結果Table 3 Sugar fermentation and acid production abilities

純化酵母菌的碳、氮源同化能力測定如表2所示。所有菌株均能同化選用的碳源及酵母浸粉，均不能同化尿素，5號菌株不能同化硫酸銨、硝酸鉀和硝酸銨，6號菌株不能同化硫酸銨。如表3所示，在實驗所采用的糖類范圍內，所有菌株均不能發酵產氣，同時除4號菌株外均不能利用糖發酵產酸。9 株酵母菌都未發現其發酵產乙醇，都無令人愉快的酯香。

2.3 篩選所得菌株的分子生物學鑒定

將篩選到的菌株進行2 6 S r D N A測序，利用MEGA 6.0軟件，進行多序列同源性比對，繪制系統發育樹結果如圖3所示，1～3號菌株為膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）；4號菌株為白假絲酵母（Candida albicans）；5～7、9號菌株為涎沫假絲酵母（Candida zeylanoides）；12號菌株為金黃蝶形擔孢酵母（Papiliotrema aurea），又名金黃色隱球酵母（Cryptococcus aureus）[31-32]。

圖3 基于26S rRNA基因序列的系統發育樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on 26S rRNA gene sequences

2.4 產胞外多糖酵母菌的生長曲線及發酵特性

圖4 酵母菌發酵過程中生物量、pH值及胞外多糖產量的變化Fig. 4 Biomass, pH and EPS production during yeast fermentation

由圖4可知，9 株酵母的生物量均在發酵前期迅速增加，pH值迅速降低，而胞外多糖在發酵中期開始積累，發酵后期達到最大。根據研究表明，菌體生長與胞外多糖的合成為部分偶聯型[33]，胞外多糖可能為酵母菌的次級代謝產物[34]，因此在提高酵母菌胞外多糖產量時，必須同時考慮其生長特性。

在發酵168 h時，12號的胞外多糖的產量最高，可達3 510.69 mg/L，2號菌株也較高，產量為2 384.03 mg/L，其余菌株產量較低，介于800～1 500 mg/L之間。孫曉萌等[35]從海參腸篩選出1 株假絲酵母，胞外多糖產量為137 mg/L；高鵬等[19]從海參腸篩選出1 株假絲酵母，優化后胞外多糖產量為762 mg/L；包怡紅等[20]從自然界中篩選出1 株東方伊薩酵母，經優化后胞外多糖產量為2 046 mg/L；Pavlova等[36]從南極分離出4 株產糖酵母，在以葡萄糖或蔗糖為碳源的培養基中胞外多糖產量分別可達1 750～2 630 mg/L及2 120～3 040 mg/L。與上述研究相比，本研究分離得到的酵母菌胞外多糖產量相對較高，具有較好的工業化生產潛力，因此最終選定高產胞外多糖的菌株12號菌株進行后續實驗，并將其命名為DF-12。

2.5 碳源對DF-12胞外多糖產量的影響

圖5 碳源對DF-12胞外多糖產量的影響Fig. 5 Effects of carbon sources on EPS production of DF-12

碳源是影響微生物發酵合成多糖最為重要的營養因子，胞外多糖產量與所采用的碳源種類直接有關，且微生物在不同碳源培養基中合成的胞外多糖具有不同的理化性質[37]，直接影響其應用效果。如圖5所示，當采用葡萄糖或蔗糖為碳源時，胞外多糖產量較高，可達3 250～3 500 mg/L；碳源為其他實驗糖類時，胞外多糖產量僅為1 500～2 500 mg/L，說明培養基中碳源種類對胞外多糖產量有較大影響。除此以外，DF-12也能利用制糖工業副產物糖蜜合成胞外多糖，產量僅略低于葡萄糖、蔗糖及果糖，在可見該菌株具有工業化發酵生產的潛力。

2.6 DF-12的胞外多糖體外抗氧化活性

圖6 DF-12胞外多糖對羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基的清除率及還原力Fig. 6 Scavenging capacity against hydroxyl, superoxide anion and DPPH radicals as well as reducing power of EPS produced by DF-12

過量的自由基能夠損害生物膜，破壞細胞氧化蛋白質和脂肪，損傷DNA，從而引起諸多疾病[38]。現有研究表明，酵母菌的胞外多糖具有較強的體外抗氧化能力，對羥自由基[10,29]、DPPH自由基[39]、超氧陰離子自由基[39]有較強的清除能力和還原力[40]。本研究以VC作為陽性對照，測定DF-12胞外多糖活性。由圖6可知，在較低質量濃度時，VC對超氧陰離子自由基和DPPH自由基有較強的清除效果，而對羥自由基的清除率與質量濃度表現出良好的劑量-效應關系。綜合來看，酵母菌胞外多糖對羥自由基、DPPH自由基的清除率及還原力均隨質量濃度增加而增大，在質量濃度高于6 mg/mL時還原力甚至高于同等濃度的VC，但對羥自由基清除率較低。該實驗表明DF-12胞外多糖具有良好的體外抗氧化活性，具備開發為食品或藥品的潛力。

3 結 論

本研究以云南傳統乳制品乳扇為材料，從中分離篩選出9 株產胞外多糖的酵母菌并進行鑒定，其中1 株金黃蝶形擔孢酵母，又名金黃色隱球酵母，具有較好的胞外多糖合成能力，在以葡萄糖和蔗糖為碳源的培養基中胞外多糖產量可達3 510 mg/L左右，高于目前所報道的絕大多數酵母菌株，且其所合成的胞外多糖具有較好的抗氧化能力。碳源實驗表明所得菌株具備利用糖蜜產胞外多糖的能力，且產量高于現有類似報道[41]，展示出其在工業化生產中的巨大潛力。此外，近年來對酵母菌胞外多糖的研究大多集中于為釀酒酵母、膠紅酵母、黏質紅酵母、白假絲酵母、畢赤酵母等[5]，而本研究報道了金黃蝶形擔孢酵母具備高產胞外多糖的能力，為開發產胞外多糖的酵母菌資源提供了新的思路。