Bacillus amyloliquefaciens YM6 對鹽脅迫條件下玉米促生長作用研究

王華笑 劉環 楊國平，2，3 張琇，2，3 李壯 張炎

（1. 北方民族大學生物科學與工程學院，銀川 750021；2. 寧夏特殊生境微生物資源開發與利用重點實驗室，銀川 750021；3. 國家民委發酵釀造工程生物技術重點實驗室，銀川 750021；4. 新疆農業科學院土壤肥料與農業節水研究所，烏魯木齊 830091）

土壤鹽漬化是土地退化中的最大難題，也是生態環境惡化的一種現象，土地鹽漬屬于土地荒漠化的一種［1］，嚴重影響著畜牧業和農業的發展［2］。我國西北地區鹽漬地面積大、鹽堿化程度高，解決鹽脅迫問題，促進農作物產出對西北地區農業持續發展具有特殊意義［3］。

研究顯示，植物根際促生細菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）在降低鹽脅迫對植物影響方面發揮著重要作用［4］。PGPR 不僅能夠合成對植物生長發育有直接作用的物質（如生長素等［5］）或提高土壤中某些元素的溶解度［6］，還可抑制或減輕某些植物病害對植物生長發育和產量的不良影響［7-8］。付健［9］發現接種菌根真菌可提高植物的耐鹽堿能力。

寧夏特殊生境微生物資源開發與利用重點實驗室篩選獲得一株能提高玉米耐鹽堿性能的菌株YM6，經生理生化及16S rRNA 同源性序列比對、鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。解淀粉芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一個亞種［10-12］，能夠與植物共生［13］，大量研究表明解淀粉芽孢桿菌可提高作物抗性［14］，在誘導植物抗病蟲和誘導系統抗病性等發揮重要作用［15］。連彩等［16］研究表明解淀粉芽孢桿菌可產生IAA 促進植物生長，但該菌在鹽脅迫條件下促進植物生長作用尚未見到報道。

本研究以鄭單958 玉米為材料，探究不同鹽濃度對玉米幼苗根長、株高、莖粗、葉綠素含量等的影響，進一步探究YM6 在鹽脅迫下對玉米的促生作用，旨在為提高玉米等非耐鹽作物產量開發新型菌源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試玉米種 鄭單958，選擇顆粒飽滿、無破損、大小一致的玉米種子作為試驗種。

供試菌株：保存于寧夏特殊生境微生物資源開發與利用重點實驗室、促進玉米耐鹽堿的菌株解淀粉芽孢桿菌YM6（Bacillus amyloliquefaciens），在TSA（胰酪大豆胨固體培養基）試管培養基上保存備用。

1.1.2 梯度鹽溶液的配置 用NaCl 調節鹽濃度，以Na+為鹽脅迫主要離子，根據鹽堿土分類標準［1］配制梯度鹽溶液（0、25、50、75、100、125 和150 mmol/L）。

母液2：MgSO4·7H2O 24.648 g 和去離子水500 mL；

母液3：K2HPO487.09 g、KH2PO468.443 g 和去離子水500 mL；

母液4：CaCl2·2H2O 55.495 g 和去離子水500 mL；

母液5：FeC6H5O7·3H2O 2.5 g 和去離子水500 mL；

以上5種母液各取1 mL與1 000 mL蒸餾水混合，再加入3.3 g（NH4）2SO4，即得植物營養液，1×105Pa 滅菌20 min 后備用。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度鹽溶液對玉米幼苗生長的影響 選取約200 粒大小一致、飽滿無損傷的玉米用95%酒精浸泡5 s 去除種子表面張力，0.1% HgCl 表面消毒40 s，無菌水沖洗4-7 次。置于鋪有濕潤無菌紗布的培養皿內，于25℃黑暗條件下培養48-72 h，萌發備用。以無鹽脅迫，即正常生長條件的玉米為對照，記為CK0；以不同濃度鹽脅迫條件下的玉米生長組為試驗組。

每個處理設置3 個重復（培養瓶），每個組培養瓶內種植4 株玉米苗。所有處理均放置于光照培養箱（25℃，16 h 光照與18℃，8 h 黑暗）中培養，光照強度20 000 Lx。培養至14 d 有明顯區別后統計玉米的株高、根長、植株干重、植株鮮重等生長指標。

1.2.2 YM6 菌株對提高玉米幼苗耐鹽性能的影響 將催芽后的玉米幼苗種植于含有75 mmol/L NaCl 的培養瓶中，接種濃度為1×108CFU/mL 的YM6 菌株，接種量為20 μL/瓶，滴加于玉米幼苗根系。以無鹽脅迫、不接種試驗菌株組設為空白對照組，記為CK0；以鹽脅迫、不接種組設為脅迫對照組，記為CK1。每瓶4 株玉米苗，每個處理設置3 個重復，所有處理均放置于光照培養箱（25℃，16 h 光照與18℃，8 h 黑暗）中培養，光照強度20 000 Lx。培養至14 d 有明顯區別后，測量玉米的株高、根長、植株干重、鮮重等生長指標。

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1.2.3 鹽漬土盆栽條件下YM6 菌株對玉米植株生長的影響 取田間鹽漬土（鹽濃度為0.45%），選擇顆粒飽滿大小一致的玉米種子種植于鹽漬土中每盆3 粒種子（容器直徑6 cm，高10 cm，容積為150 mL），每組5 個平行，記為鹽脅迫組CK1，試驗組添加YM6 菌株，接種濃度為1×108CFU/mL，接種量為1 mL/盆；以無鹽育苗土（鹽濃度為0.01%）為空白對照，每隔30 d 統計玉米植株生長情況。

1.2.4 YM6 菌株在鹽漬土中定殖試驗 取鹽漬土（鹽濃度0.45%）分裝為3 kg/袋，25 kGy 輻照滅菌備用。試驗組將催芽后的玉米苗盆栽于鹽漬土中（容器直徑6 cm，高10 cm，容積為150 mL），滴加1 mL 濃度為1×108CFU/mL 的菌懸液于玉米根系；對照組不種植玉米苗，取與試驗組相同濃度、體積的YM6菌株接入到鹽漬土中。

計算公式為：1 g 土壤菌數（CFU/g）=平板菌數×10 mL×105

1.2.5 指標測定方法 株高、根長利用直尺測量；莖粗采用游標卡尺測量；葉綠素含量采用日立-SPAD502 葉綠素儀測量；植株干鮮重利用千分之一天平稱。

1.2.6 數據分析 采用Excel 2003 軟件對試驗數據進行分析并制圖；利用SPSS 17.0 軟件進行差異顯著性分析（Duncan 法，P＜0.05）。

2 結果

2.1 鹽脅迫對玉米幼苗生長的影響

由表1 可見，鄭單958 玉米對低濃度鹽脅迫有一定耐受性，鹽濃度為25 mmol/L 時對玉米苗幾乎沒有影響，鹽濃度為50 mmol/L 時，根長與CK0 相比無顯著性差異。當鹽濃度為75 和100 mmol/L 時，株高、根長、干鮮重等指標均顯著降低（P＜0.05）。鹽濃度為100 mmol/L 時，幼苗生長受抑制程度過大，不利于驗證加菌對提高玉米耐鹽性能試驗，因此，選用鹽濃度為75 mmol/L 進行后續試驗。

表1 不同鹽濃度對玉米生長指標的影響

2.2 YM6菌株對鹽脅迫條件下玉米幼苗生長的影響

從表2 可以看出，在鹽脅迫條件下隨著玉米幼苗生物量呈明顯降低趨勢，與對照組（CK0）相比，鹽脅迫組CK1 株高減少量為33.7%；根長減少量32.8%。并且加入YM6 菌株時，鹽脅迫條件下的玉米生物量呈上漲趨勢，75 mmol/L 條件下，加入YM6 菌株試驗組株高增長15.2%，根長增長22.3%，同時干鮮重表現均有明顯差異（P＜0.05）。

2.3 鹽漬土土培條件下YM6菌株對玉米幼苗生長的影響

從圖1 和表3 可以看出，在鹽漬土盆栽條件下，鹽脅迫對玉米生長有明顯抑制作用（P＜0.05），這種抑制作用隨著時間的延長并沒有得到緩解。當加入YM6 菌株時，對鹽脅迫條件下玉米生長有明顯促進作用，甚至有的植株個體超過對照組CK0，最大增長量為116.7%。

表2 鹽濃度為75 mmol/L 時YM6 菌株對玉米幼苗生長影響

圖1 接種YM6 菌株后玉米幼苗的生長情況

表3 接種YM6 菌株后玉米幼苗的生長指標統計

2.4 鹽脅迫下YM6菌株在玉米幼苗根系定殖試驗

從圖2 可看出，種植玉米條件下YM6 菌株菌體數量明顯高于無玉米條件，試驗測得YM6 菌株定殖數在第4 天前呈增長趨勢，第4 天后菌體數量增長呈減緩趨勢，無玉米對照組菌株定殖數量在第4 天后呈緩慢下降趨勢。說明YM6 菌株在第4 天達到最大定殖數量從而穩定發揮作用提高玉米耐鹽性。

3 討論

圖2 YM6 菌株在鹽漬土中定殖能力

鹽脅迫對植物生長抑制是一個復雜的生理生化過程，研究表明鹽脅迫下植物生長滯后，生物量降低［18］。本研究結果表明，隨著鹽濃度的增加，玉米植株生物量呈顯著降低趨勢，這與李文陽［19］對鹽脅迫不同品種玉米苗期生長的影響研究結果一致，當鹽濃度大于75 mmol/L 時，鹽脅迫對玉米幼苗生長有顯著抑制作用，玉米葉片葉綠素含量卻呈先增加后下降趨勢，據文獻報道，低鹽條件下利于葉綠素的積累增加光合作用，鹽濃度過高時，鹽脅迫對植物葉綠體損傷不利于葉綠素合成。

YM6 菌株通過促進根系生長，增加玉米植株對營養元素的吸收，補充鹽脅迫對玉米植株的營養虧空［20］，促進玉米植株生長，進而改變玉米植株生物量。但當鹽濃度過大接種YM6 菌株對幼苗生長恢復效果較差，可能是由于鹽脅迫對玉米幼苗損害程度大，微生物作用程度小難以恢復玉米的生長。鹽漬土盆栽試驗接種YM6 菌株可明顯促進玉米生長，并且在種植60 d 后，測定玉米植株干重較鹽脅迫不接菌組相比增加43.9%，其機理可能是微生物與玉米植株相互作用，誘導植株產生某些與耐鹽性能有關的代謝產物，從而降低鹽脅迫對玉米毒害作用［21］。試驗發現YM6 菌株能在玉米根系繁殖并保持數量穩定，YM6 菌株利用玉米根系分泌的營養物質使自身數量增加從而更好的發揮作用提高玉米耐鹽性能。但對于菌YM6 最佳條件如作用時間，以及最佳接菌量等問題還值得我們進一步探究。

4 結論

高濃度鹽脅迫明顯抑制玉米植株長勢，接種YM6 菌株可提高玉米耐鹽性，改變根系長勢，緩解鹽脅迫對玉米生長抑制，提高玉米植株干鮮重、莖粗、株高等生長指標，同時YM6 菌株可定殖于玉米根系穩定發揮作用促進玉米生長。