綿羊BMPR1B 基因真核表達(dá)及產(chǎn)物互作蛋白的鑒定

賈建磊 陳倩 靳繼鵬 袁贊 張利平

（1. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070）

卵泡發(fā)生是母羊卵巢功能的基礎(chǔ)，包括受精過(guò)程中成熟卵母細(xì)胞的產(chǎn)生及維持母羊發(fā)情周期所需要的生殖激素的生成［1］。骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B 基 因（Bone morphogenetic protein receptor 1B，BMPR1B）屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 超家族，在許多組織和器官中通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖等生理過(guò)程對(duì)哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育、胎兒出生后發(fā)育及激素釋放等起重要作用［2］。綿羊BMPR1B基因第8 外顯子（A746G）發(fā)生突變，突變體BB 個(gè)體卵巢部分功能喪失，使得此受體對(duì)配體GDF5和BMP4不敏感，從而高劑量的GDF5便抑制了孕胴的分泌，使排卵率增加，產(chǎn)仔數(shù)增加。近幾年來(lái)，大量研究表明，BMPR1B基因是Booroola Merino 羊、劍橋羊以及我國(guó)小尾寒羊和湖羊的多胎主效基因［3-4］。

BMPR1B 蛋白是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在綿羊卵巢內(nèi)廣泛的表達(dá)（包括顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞）［5］。BMPR1B具有同絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶受體結(jié)構(gòu)類似的信號(hào)傳遞機(jī)制，其主要功能是參與哺乳動(dòng)物卵巢卵泡發(fā)育、動(dòng)物的胚胎發(fā)育、骨組織形成、癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及大腦組織恢復(fù)等［8-10］。BMPR1B 蛋白包含3 部分：N 末端胞外配體結(jié)合域、單跨膜區(qū)域和C 末端絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域（GS）。BMPR1B基因編碼區(qū)第746 位點(diǎn)A →G 的突變，使受體胞內(nèi)激酶區(qū)第249 位氨基酸由谷氨酰胺變?yōu)榫彼?，突變后的BMPR1B 蛋白與配體結(jié)合時(shí)，BMPR-IIB 可將BMPR1B 蛋白的GS 結(jié)構(gòu)域磷酸化，由于磷酸化的存在，增強(qiáng)了GS 結(jié)構(gòu)域?qū)τ贗 型受體信號(hào)傳導(dǎo)。同時(shí)，GS 結(jié)構(gòu)域中的磷酸化位點(diǎn)被II 型受體磷酸化，阻止I 型受體的磷酸化，導(dǎo)致下游級(jí)聯(lián)的激活并使部分受體失活。進(jìn)而使配體GDF5 和BMP4 對(duì)類固醇生成的抑制作用減弱，改變SMADs的表達(dá)和磷酸化的狀態(tài)，促進(jìn)FSH 誘導(dǎo)雌激素的合成，抑制孕酮的合成與分泌，結(jié)果使攜帶BB 突變體的母羊顆粒細(xì)胞加快分化，促使卵泡成熟速度加速，引起突變型母羊排卵數(shù)增加，被稱為FecB突變［11］。據(jù)報(bào)道，BMPR1B基因是綿羊高繁殖力的主效基因和控制綿羊繁殖性能遺傳的重要候選基因［8］。

隨著后基因組學(xué)時(shí)代的到來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、生物信息學(xué)等方面的研究在功能基因和分子生物學(xué)上展現(xiàn)出前所未有的優(yōu)勢(shì)。目前為止，BMPR1B基因研究的主要集中在運(yùn)用分子遺傳學(xué)和DNA 分子遺傳標(biāo)記（MAS）技術(shù)探索其多態(tài)性與綿羊產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)性，蛋白質(zhì)為生物功能的執(zhí)行者，為了探究BMPR1B及其相互作用蛋白的假定生物學(xué)功能，預(yù)測(cè)BMPR1B及其相互作用蛋白的作用通路，揭示了BMPR1B及其互作蛋白和綿羊產(chǎn)羔數(shù)的生物學(xué)功能聯(lián)系。本研究通過(guò)構(gòu)建BMPR1B基因真核表達(dá)體系并表征BMPR1B 蛋白質(zhì)，通過(guò)生物信息學(xué)分析并預(yù)測(cè)BMPR1B 蛋白及其相互作用蛋白在綿羊卵巢卵母細(xì)胞發(fā)育及排卵的作用通路。從蛋白質(zhì)角度進(jìn)行BMPR1B對(duì)綿羊產(chǎn)羔性狀作用通路進(jìn)行研究，旨為進(jìn)一步研究了BMPR1B作為綿羊產(chǎn)羔性狀主要基因的生物學(xué)功能和特異性診斷試劑的開發(fā)奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所有程序均按照青海大學(xué)動(dòng)物福利及動(dòng)物倫理指南進(jìn)行。2018 年3-5 月購(gòu)自青海省海東市樂(lè)都金元牧業(yè)有限公司6 只成年健康經(jīng)產(chǎn)且有產(chǎn)羔記錄的小尾寒羊經(jīng)頸動(dòng)脈放血屠宰后采集卵巢，剝離卵巢表面韌帶及脂肪后，無(wú)菌水沖洗立即置于液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1BMPR1B基因的PCR 擴(kuò)增及克隆 根據(jù)GenBank 上提交的BMPR1B全基因mRNA 的堿基序列（登錄號(hào)：NM_001009431.1），運(yùn)用Primer Prim 5.0設(shè)計(jì)BMPR1B基因編碼區(qū)PCR 引物。F：5′-CCGCT CGAGAACATGCTTTTGCGAAGTTCAG-3′，R：5′-CGC GGATCCCAGAGCTTAATGTCCGGGACT-3′，擴(kuò)增片段大?。? 509 bp，劃線部分為酶切位點(diǎn)（上游為XhoI，下游為BamH I）。

卵巢總RNA 提取后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（擴(kuò)增條件：94℃變性4 min；94℃ 40 s，60℃ 40 s，72℃ 110 s，35 個(gè) 循 環(huán)；72℃ 10 min）。PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后使用凝膠回收試劑盒將目的條帶進(jìn)行凝膠回收。使用T4 DNA連接酶將純化的PCR 產(chǎn)物連接到pMD19-T 中，4℃過(guò)夜。使用熱休克方式在42℃將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α 細(xì)胞中90 s，然后冰上孵育。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在含有50 mg/mL 氨芐青霉素的LB 瓊脂上過(guò)夜培養(yǎng)。挑取白色斑點(diǎn)，轉(zhuǎn)移至含有氨芐青霉素的LB 肉湯培養(yǎng)基中37℃過(guò)夜培養(yǎng)，進(jìn)行菌液PCR，選擇陽(yáng)性克隆，送上海生工生物工程公司測(cè)序。使用酚-氯仿將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物pMD19-T-BMPR1B進(jìn)行純化，將提取的pcDNA3.1a 真核表達(dá)質(zhì)粒載體和構(gòu)建的pMD19-T-BMPR1B克隆載體用限制性內(nèi)切酶BamH I 和XhoI 分別進(jìn)行雙酶切（雙酶切體系：pcDNA3.1a 10 μL，pMD19-T-BMPR1B10 μL，BamH I 0.5 μL，XhoI 0.5 μL，10×K Buffer 2 μL，加無(wú)菌水至20 μL。37℃酶切4 h），2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，凝膠回收空載體和目的基因片段。用T4 連接酶連接目的基因片段和空載體（連接體系：T4 DNA 連接酶 1 μL，空載體1 μL，目的基因片段10 μL，連接Buffer 2.5 μL，加無(wú)菌水至25 μL，16℃過(guò)夜連接）。將25 μL 連接產(chǎn)物加入100 μL 感受態(tài)大腸桿菌中，冰浴30 min；42℃熱激45 s，再冰浴1 min；加入1 mL LB 培養(yǎng)基，37℃，170 r/min，搖床培養(yǎng)1 h，離心后取200 μL 菌液置于含有氨芐青霉素的LB 肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，過(guò)夜培養(yǎng)，挑取白色斑點(diǎn)，菌液PCR 檢測(cè)陽(yáng)性克隆，送生工生物工程公司（上海）進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 重組靶基因的真核表達(dá) 使用Sf 9 細(xì)胞進(jìn)行BMPR1B基因的蛋白質(zhì)體外表達(dá)。將10 mL Sf9 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的Grace’s 培養(yǎng)基中；取8×105個(gè)細(xì)胞加入六孔板中，室溫靜置20 min，使細(xì)胞貼壁；將20 μL 質(zhì)粒DNA（20 μg）稀釋于200 μL 胎牛血清Grace′s 培養(yǎng)基中，同時(shí)將100 μL 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑（QIAGEN）稀釋于1 mL 胎牛血清Grace′s 培養(yǎng)基中，然后將稀釋的質(zhì)粒DNA 滴加到稀釋的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑中并輕輕混合以避免沉淀，在室溫下放置20 min 后將混合液加入到Sf 9 細(xì)胞中，并在28℃下在水平振蕩器上以150 r/min 溫育直至細(xì)胞“病變”（CPE）超過(guò)80%（達(dá)到最大靶蛋白表達(dá)，72 h-96 h），分別收集上清液和沉淀物，分離并純化重組蛋白的純化。

1.2.3 單克隆抗體的制備 抗BMPR1B單克隆抗體的制備由美國(guó)GenScript 公司完成。用體外表達(dá)的BMPR1B 蛋白免疫6 只Bal b/c 小鼠，每次免疫7 d，加強(qiáng)免疫后用間接ELISA 方法檢測(cè)免血清效價(jià)，當(dāng)效價(jià)大于1∶64 000，采用電融合方法進(jìn)行細(xì)胞融合后篩選針對(duì)靶蛋白呈陽(yáng)性融合細(xì)胞的上清液，將陽(yáng)性母克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行亞克隆篩選后進(jìn)行BMPR1B單克隆抗體的制備，采用Protein A/G 親和層析方法純化。

1.2.4 母羊卵巢BMPR1B相互作用蛋白的鑒定 分別使用試劑盒免疫沉淀法和常規(guī)免疫沉淀法進(jìn)行母羊卵巢BMPR1B相互作用蛋白的鑒定，每種方法進(jìn)行3 次重復(fù)。單獨(dú)表達(dá)空載體的Sf9 細(xì)胞用作陰性對(duì)照。對(duì)于試劑盒免疫沉淀法，按照說(shuō)明是使用Mag sProtein A/G Co-Immunoprecipitation 試 劑 盒（BioCanal）富集母羊卵巢中的BMPR1B及其相互作用蛋白。對(duì)于常規(guī)免疫沉淀法，在4℃條件下，用500 μL 的0.5% NP40 裂解緩沖液裂解母羊卵巢30 min。將沉淀物在PBS 中洗滌2 次后4℃下用500 μL的1% NP40 裂解緩沖液裂解，并在水浴超聲波儀中2 級(jí)超聲處理4 個(gè)循環(huán)。將3 mg 總蛋白用于50 μg IgA 進(jìn)行免疫沉淀。

1.2.5 蛋白質(zhì)鑒定和生物信息學(xué)分析 MALDI-TOF/TOF 結(jié)合Mascot 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定目的蛋白。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組以上調(diào)和下調(diào)3.0 倍來(lái)鑒定差異蛋白質(zhì)（P＜0.05）。使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合BLAST2GO 軟件進(jìn)行差異蛋白質(zhì)的功能注釋和分類；使用KAAS平臺(tái)進(jìn)行通路分析（http：// www.genome.jp/kegg/mapper.html），同時(shí)通過(guò)Fisher 精確檢驗(yàn)進(jìn)行通路富集統(tǒng)計(jì)（P＜0.05）；使用Cytoscape 3.0 軟件用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。

2 結(jié)果

2.1 綿羊總RNA提取及PCR擴(kuò)增

提取的小尾寒羊卵巢總RNA 結(jié)果見(jiàn)圖1，提取的小尾寒羊卵巢總RNA 明顯可見(jiàn)28S 與18S 兩條帶，提取效果較好，可直接用于反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄PCR 擴(kuò)增BMPR1B基因編碼區(qū)序列，結(jié)果見(jiàn)圖2，擴(kuò)增片段與目的片段大小一致（1 509 bp）且特異性良好，可直接進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 重組BMPR1B基因的真核表達(dá)

通過(guò)XhoI 和BamH I 限制酶消化DNA 質(zhì)粒后結(jié)果表明，用XhoI 和BamH I 限制酶切割質(zhì)粒pcDNA3.1a-BMPR1B發(fā)現(xiàn)兩條帶，在瓊脂糖凝膠電泳上產(chǎn)生預(yù)期的DNA 片段（1 509 bp），而pMD19-T-NP 僅有一條帶（未發(fā)現(xiàn)預(yù)期的DNA 片段）。證實(shí)BMPR1B基因成功連接到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1a中，插入的DNA 的大小與PCR 產(chǎn)物相同（圖3）。

圖1 綿羊卵巢總RNA 提取

圖2 綿羊BMPR-1B 基因PCR 結(jié)果

圖3 用Xho I 和BamH I 酶消化的DNA 質(zhì)粒瓊脂糖電泳檢測(cè)

2.3 抗BMPR1B單克隆抗體的產(chǎn)生

將重組真核質(zhì)粒pcDNA3.1a-BMPR1B轉(zhuǎn)染于Sf 9 昆蟲細(xì)胞，28℃培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)3 次傳代后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)（“CPE”），轉(zhuǎn)染pcDNA3.1a-BMPR1B重組質(zhì)粒24 h 后，結(jié)果顯示pcDNA3.1a-BMPR1B轉(zhuǎn)染組“CPE”熒光強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組（圖4）。連續(xù)監(jiān)測(cè)7 d后，表明轉(zhuǎn)染后72 h-96 h之間“CPE”表達(dá)最高。

如圖5 所示，重組蛋白條帶主要出現(xiàn)在沉淀中，使用Ni-NTA Superflow 蛋白純化試劑盒純化重組蛋白（圖6，圖7）。當(dāng)OD450nm的陽(yáng)性/陰性（P/N）大于或等于2.1 時(shí)，判斷血清抗體滴度。ELISA 結(jié)果顯示通過(guò)4 次免疫獲得高滴度（1∶32 000）的大鼠抗BMPR1B血清。

圖4 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后的Sf 9 細(xì)胞（100×，左）和未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的Sf 9 細(xì)胞（100×，右）

圖5 體外表達(dá)蛋白的檢測(cè)

圖6 重組蛋白的純化

圖7 BMPR1B 抗體Western Blotting 檢測(cè)

2.4 綿羊卵巢BMPR1B相互作用蛋白的鑒定

綿羊卵巢BMPR1B相互作用蛋白結(jié)果表明，BMPR1B抗體可以有效地和特異性地從母羊卵巢提取物中沉淀相互作用蛋白。使用SDS-PAGE 電泳分離沉淀蛋白質(zhì)（圖8），結(jié)果表明，載有BMPR1B-IP（樣品1-6）存在目標(biāo)蛋白條帶，空載體IP 不存在的目標(biāo)蛋白條帶（樣品7 和8）。

常規(guī)方法和試劑盒法免疫共沉淀后目的條帶進(jìn)行膠內(nèi)酶解，并通過(guò)MALDI-TOF/TOF 質(zhì)譜進(jìn)行鑒定，與Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)中Ovis aries 或Bos taurus 物種數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配，使用手動(dòng)閾值法和概率預(yù)測(cè)算法來(lái)計(jì)算63 種差異蛋白質(zhì)中與BMPR1B蛋白的關(guān)聯(lián)性，表明共產(chǎn)生34 種目的差異蛋白，其中24 種差異蛋白在實(shí)驗(yàn)組（BMPR1B抗體CoIP）和對(duì)照組（空白抗體CoIP）中表達(dá)量差異3 倍或3 倍以上（表1）。

2.5 BMPR1B互作蛋白的驗(yàn)證

圖8 BMPR1B 相互作用蛋白的鑒定

采用CoIP 試劑盒方法進(jìn)行BMPR-1B 蛋白及相互作用蛋白免疫共沉淀，直接作用產(chǎn)物經(jīng)洗脫純化后用SDS-PAGE 凝膠電泳進(jìn)行分離（圖9），共分離6 個(gè)條帶，經(jīng)生物質(zhì)譜鑒定與BMPR-IB 相互作用蛋白，共獲5 種蛋白，分別為GDF5、BMP2、BMP4、RhoD 和HSP10。采用免疫印跡法（Western Blotting）驗(yàn)證BMPR-1B 蛋白與母羊卵巢提取物免疫共沉淀的復(fù)合蛋白（BMP2、BMP4、GDF5、GDF9、RhoD 和HSP10）的特異性相互作用（陽(yáng)性和陰性驗(yàn)證，圖10），表明所選候選蛋白與BMPR-1B 具有特異性相互作用。

表1 CoIP-MS 鑒定BMPR1B 相互作用蛋白表

圖9 BMPR1B 相互作用蛋白SDS-PAGE 電泳鑒定

圖10 BMPR1B 相互作用蛋白正反向Western Blotting驗(yàn)證

2.6 GO及KEGG分析

為預(yù)測(cè)和鑒定與BMPR1B相互作用蛋白相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程，我們通過(guò)基因本體論（Gene ontology，GO）方法對(duì)目的蛋白過(guò)程進(jìn)行富集分析（圖11）。分析結(jié)果表明差異蛋白主要參與的“生物過(guò)程”包括繁殖和細(xì)胞質(zhì)翻譯過(guò)程，其中繁殖過(guò)程包含兩個(gè)方向：（1）與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)：如“TGF-β 信號(hào)通路”和“細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用”；（2）與發(fā)育相關(guān)：如“生物調(diào)節(jié)”，“細(xì)胞過(guò)程”，“生長(zhǎng)”和“代謝過(guò)程”。細(xì)胞質(zhì)翻譯過(guò)程主要包括“下游處理”和“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”。另外富集分析結(jié)果還包括與試驗(yàn)主題關(guān)聯(lián)性較小的生物過(guò)程，如“色素沉積”和“免疫系統(tǒng)過(guò)程”。

圖12 BMPR1B 及其互作蛋白GO 條目富集分析

圖11 BMPR1B 及其互作蛋白GO 分析

為進(jìn)一步深入探討GO 分析所確定的生物過(guò)程，根據(jù)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果通過(guò)Fisher 精確檢驗(yàn)獲取顯著富集條目（P＜0.05），并將這些條目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析得到與綿羊繁殖性狀顯著相關(guān)聯(lián)的生物過(guò)程（圖12）。結(jié)果表明，BMPR1B及其互作蛋白主要在“正向生物調(diào)節(jié)”，“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”，“細(xì)胞過(guò)程”和“生殖過(guò)程”過(guò)程呈現(xiàn)富集狀態(tài)，其中“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”和“生殖過(guò)程”過(guò)程的鑒定主要是因?yàn)锽MPR1B相互作用蛋白質(zhì)中存在TGF-β 家族蛋白質(zhì)，如BMPs 等，“正向生物調(diào)節(jié)”和“細(xì)胞過(guò)程”過(guò)程的鑒定主要是因?yàn)锽MPR1B相互作用蛋白質(zhì)中存在起始和延伸因子，如BMP2 和BMP4。

使用KAAS 平臺(tái)鑒定與BMPR1B相互作用蛋白相關(guān)KEGG 途徑。結(jié)果表明，共鑒定到103 條代謝通路，運(yùn)用Fisher 精確檢驗(yàn)獲取28 條顯著富集通路（P＜0.05），按評(píng)分和重疊百分比排名的前6 個(gè)途徑分別為：“TGF-β 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路”，“卵巢類固醇生成通路”，“MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路”，“細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用”，“Hippo 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路”和 “信號(hào)通路調(diào)節(jié)干細(xì)胞的多能性”（圖13-14）。KEGG 結(jié)果與GO 分析結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證BMPR1B相互作用蛋白所涉及的各種生物學(xué)功能。

2.7 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用通路預(yù)測(cè)分析

圖13 BMPR1B 及其互作蛋白KEGG 分析

圖14 BMPR1B 及其互作蛋白KEGG 富集分析

圖15 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

以試驗(yàn)篩選的24 種目的蛋白為基礎(chǔ)，結(jié)合UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG 圖譜，利用可視化軟件Cytoscape 軟件構(gòu)建出蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)（圖15）。結(jié)果表明，TGF-β 信號(hào)通路、卵巢類固醇生成通路和MAPK 信號(hào)通路構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜且緊密的交互網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)許多其他的信號(hào)通路也基于此交互網(wǎng)絡(luò)與其他通路之間相互作用。基于互作結(jié)果，我們?cè)O(shè)計(jì)了BMPR1B調(diào)節(jié)綿羊卵母細(xì)胞的發(fā)育和排卵的代謝途徑途徑（圖16），在該預(yù)測(cè)途徑中最具交互作用的蛋白質(zhì)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的，表明其在綿羊卵母細(xì)胞發(fā)育和排卵中具有重要作用。

3 討論

綿羊卵巢卵母細(xì)胞的成熟和排卵主要是受促性腺激素的調(diào)節(jié)，即卵泡刺激素（FSH）和促黃體激素（LH），促性腺激素激素（FSH 和LH）的釋放最初是由卵巢內(nèi)各種因素的控制［7］。研究表明，BMPR1B基因在綿羊卵巢中廣泛表達(dá)，包括顆粒細(xì)胞，卵母細(xì)胞，卵泡和黃體［12］。蛋白質(zhì)在核糖體內(nèi)合成后被轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的細(xì)胞器中參與細(xì)胞的各種生命活動(dòng)，有效地發(fā)揮功能［13］。BMPR1B蛋白作為一種跨膜蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞與外界之間的信號(hào)傳導(dǎo)，參與許多細(xì)胞功能（如構(gòu)成各種信號(hào)分子、激素和其他底物的受體）和細(xì)胞膜內(nèi)外物質(zhì)交換、能量和信號(hào)的傳遞等［14］。本研究使用CoIP-MS 技術(shù)來(lái)鑒定BMPR1B 蛋白及其互作蛋白并深入了解其與母羊卵巢中相互作用蛋白的調(diào)節(jié)通路。與文獻(xiàn)報(bào)道相同，Samds 是在綿羊產(chǎn)羔性狀代謝通路中最突出的蛋白質(zhì)家族。研究表明GDF5 和BMP4 是BMPR1B的天然配體，直接影響綿羊顆粒細(xì)胞分泌孕酮［15］；BMP2 作用于卵巢、子宮，通過(guò)抑制cAMP 的釋放以及孕酮、雌二醇和雄烯二酮激素的合成調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)，影響動(dòng)物的繁殖性狀［16］；RhoD 蛋白在機(jī)體內(nèi)參與MAPK 信號(hào)通路，通過(guò)各種生物和理化刺激被激活后參與細(xì)胞分化、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞生理過(guò)程［17］；HSP10 通過(guò)直接或間接的方式參與細(xì)胞增殖凋亡、炎性免疫反應(yīng)、生殖等過(guò)程［18］。

圖16 綿羊卵母細(xì)胞發(fā)育和排卵過(guò)程預(yù)測(cè)通路圖［24，27，32］

BMPs 參與多種細(xì)胞活動(dòng)，如增殖，分化，遷移和凋亡［19］。卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂成熟需要將未成熟的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化為完全成長(zhǎng)的卵母細(xì)胞，這種卵母細(xì)胞存在于卵巢前卵泡中，進(jìn)行受精準(zhǔn)備，這一過(guò)程受垂體促性腺激素與各種自分泌和旁分泌的BMP家族的基因相互作用調(diào)節(jié)［20］。BMP 信號(hào)通路是調(diào)控胚胎和細(xì)胞發(fā)育的重要信號(hào)通路之一，與其他信號(hào)途徑之間交互廣泛：如MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、TGF-β 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Hippo 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 及Canonical Wnt/β-catenin通路等，同時(shí)BMP 信號(hào)通路還會(huì)對(duì)microRNA 基因表觀遺傳學(xué)、鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂等有一定的調(diào)控［21-23］。

通過(guò)生物信息學(xué)分析結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道，我們推斷目的蛋白主要通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（Smads蛋白途徑、p38-MAPK 途徑）和細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（Erk-MAP 激酶途徑）對(duì)綿羊產(chǎn)羔性狀進(jìn)行調(diào)控：（1）Smads 蛋白途徑［24-26］：原始卵泡的發(fā)育啟動(dòng)不依賴于垂體促性腺激素，而受卵巢中自分泌/或旁分泌因子（細(xì)胞因子）的調(diào)控，BMPR1B 蛋白的183-205 個(gè)氨基酸之間存在跨膜區(qū)，為蘇氨酸-絲氨酸激酶受體，當(dāng)卵巢中的自分泌/或旁分泌因子（如胰島素樣生長(zhǎng)因子IGFs）與此受體結(jié)合后細(xì)胞內(nèi)BMP 家族Ⅱ型受體通過(guò)磷酸化Ⅰ型受體的GS 區(qū)域，使胞質(zhì)內(nèi)一系列Smads 蛋白磷酸化，被激活的Smads 結(jié)合共用型的Co-Smad4 共同形成Smads 蛋白復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)DNA 的合成，進(jìn)而通過(guò)募集轉(zhuǎn)錄輔激活因子或其它因子與BMP4和GDF5下游靶基因的啟動(dòng)子相結(jié)合，調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控卵泡的發(fā)生。Smads 蛋白家族目前已證實(shí)有8 種不同的Smads 蛋白，Smad6 和Smad7 由BMP-2 蛋白激活。（2） p38-MAPK 途徑［27-30］：p38-MAPK 是MAPK 家族重要的絲氨酸/酪氨酸激酶，可磷酸化絲氨酸/酪氨酸殘基，在炎癥、細(xì)胞應(yīng)激、凋亡、細(xì)胞周期和生長(zhǎng)等多種生理過(guò)程中起重要作用。在動(dòng)物的繁殖中，p38-MAPK 途徑磷酸化HSP 10，同時(shí)在LH 作用下，使卵泡細(xì)胞以及卵泡與卵母細(xì)胞間的縫隙連接中斷，導(dǎo)致卵母細(xì)胞中cAMP 水平下降，同時(shí)鈣離子結(jié)合鈣調(diào)蛋白通過(guò)p38-MAPK 調(diào)控途徑來(lái)將GnRH 傳遞信號(hào)作用到下游蛋白酪氨酸激酶受體結(jié)合位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物繁殖性狀的調(diào)控。Ling 等［26］通過(guò)構(gòu)建小鼠HSP10基因siRNA 和超表達(dá)重組腺病毒載體及體外培養(yǎng)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，HSP10 參與卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，進(jìn)而可能影響卵泡及卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟。研究發(fā)現(xiàn)，HSP 10 在PCOS 患者間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)量降低，從而降低其抗凋亡作用，抑制卵泡的發(fā)育成熟，而在卵泡膜細(xì)胞中表達(dá)量升高，從而激活I(lǐng)GF-1通路，引起高雄激素血癥，抑制卵泡的發(fā)育成熟［31］。（3）Erk-MAP 激酶途徑［32］：由細(xì)胞外刺激因子（如生長(zhǎng)分化因子、細(xì)胞因子、Rho 家族）作用，活化MEK，使其Tyr 和Thr 殘基磷酸化，從而激活ErK途徑，磷酸化下游底物。Rho 蛋白家族作為Erk-MAP 激酶途徑的關(guān)鍵分子，在胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮橋梁作用，RhoD 蛋白在機(jī)體內(nèi)參與MAPK 信號(hào)通路，通過(guò)各種生物和理化刺激被激活后參與細(xì)胞分化、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞生理過(guò)程［33］，當(dāng)RhoD 高表達(dá)時(shí)，可以快速激活MAPK 通路，升高底物c-fos 和c-jun 的磷酸化水平，與此同時(shí)，BMP 的下游傳導(dǎo)介質(zhì)Smad1 和Smad5 也出現(xiàn)表達(dá)增加，從而誘導(dǎo)卵母細(xì)胞的分化，調(diào)控卵泡的發(fā)生［34］。

4 結(jié)論

BMPR1B 蛋白與綿羊產(chǎn)羔性狀途徑中Smads 家族蛋白具有交互作用，在綿羊卵母細(xì)胞發(fā)育和排卵中具有重要作用。本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建BMPR1B基因真核表達(dá)體系并產(chǎn)生單克隆抗體，利用CoIP-MS 技術(shù)鑒定母羊卵巢提取物中與BMPR1B特異性相互作用的蛋白質(zhì)，構(gòu)建目的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)生物信息學(xué)分析并預(yù)測(cè)BMPR1B 蛋白及其相互作用蛋白在綿羊卵巢卵母細(xì)胞發(fā)育及排卵的作用通路。母羊卵巢提取物中23 種蛋白質(zhì)與BMPR1B 蛋白具有關(guān)聯(lián)性，其中6 種目的蛋白（BMP2、BMP4、GDF5、GDF9、RhoD 和HSP10） 與BMPR1B具 有特異性相互作用，通過(guò)生物信息學(xué)分析表明目的蛋白在TGF-β 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、卵巢類固醇生成通路和MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路構(gòu)成復(fù)雜且緊密的交互網(wǎng)絡(luò)，基于互作結(jié)果設(shè)計(jì)BMPR1B 蛋白調(diào)節(jié)綿羊卵母細(xì)胞的發(fā)育和排卵的代謝途徑。BMPR1B 蛋白與綿羊產(chǎn)羔性狀途徑中Smads 家族蛋白具有交互作用，在綿羊卵母細(xì)胞發(fā)育和排卵中具有重要作用。進(jìn)一步研究BMPR1B基因的生物學(xué)功能和研究BMPR1B基因作為綿羊高繁主效基因的機(jī)理和分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。