重組綿羊FSH 在CHO-K1 細胞中的表達及其應用

王興隴 李倩 馬瑞仙 李生軍 李向茸 馮若飛

（1. 西北民族大學生物醫學研究中心 生物工程與技術國家民委重點實驗室，蘭州 730030；2. 西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730030）

促卵泡激素（Follicle stimulating hormone，FSH）是從垂體前葉嗜堿性細胞中合成并分泌的一種促性腺物質［1-2］，它屬于糖蛋白激素家族，其分子結構由α、β 兩個可解離的亞基以非共價鍵結合構成，種屬間存在差異［3-5］。FSH 與膜受體結合激活腺苷酸環化酶，進而促使環磷酸腺苷反應元件結合蛋 白CREB（cAMP-response element binding protein，CREB）發生磷酸化［6］，從而增加了P450 芳香化酶的轉錄，促進了結締組織生長因子（Connective tissue growth factor，CTGF）的表達，而CTGF 進一步促進了卵泡顆粒細胞的生長與分化，促使卵泡生成發育［7-8］。另外FSH 與膜受體結合后還可促進黃體生成激素（Luteinizing hormone，LH）受體的產生，LH 作用于細胞內膜，可產生睪酮或者十九碳底物-雄烯二酮，它們在活化的芳香酶作用下轉變為雌激素（17-β 雌二醇），雌激素進一步誘導促性腺激素生成及排卵［9］。

目前促卵泡激素被用于家禽的超數排卵與胚胎移植工作，我國在引進種羊繁殖的過程中，就使用促卵泡激素增進種羊種群的快速繁殖［10］。我國畜用FSH 多數是從垂體中提取的，但是從垂體中提取FSH 代價高昂，對工藝要求較高，感染病毒的風險較大［11-13］。醫用FSH 一般是采用尿源性的FSH，即從絕經期婦女尿液中提取，純度僅為95%，其中5%的雜質源自尿液中殘留的一些成分，這些成分大都具有蛋白性質，會影響FSH 的生物學活性［14］。并且尿源性FSH 生產成本依舊較高，如果進一步提高純度，成本會更加昂貴，所以畜用FSH 采用該種方式的可能性非常小。近年來，隨著分子生物學的快速發展，基因重組技術逐漸趨于成熟，因此使用重組DNA 技術生產FSH 成為可能，這解決了我國畜用FSH 成本高昂的問題并且為下一步工業化應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

E.coliBL21 感受態細胞，CHO-K1 全懸浮細胞（命名為CHO-K1-S2）均由西北民族大學生物醫學研究中心提供。DNA ladder 購自北京中科瑞泰生物科技有限公司；ExRed 核酸染料購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；高純質粒小提中量試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；限制性內切酶BamH I、EcoR I 均購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；綿羊促卵泡激素ELISA 檢測試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司；孕酮ELISA 檢測試劑盒、促黃體生成激素ELISA 檢測試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；促卵泡激素蛋白標準品購自武漢優爾生商貿有限公司；SFM4-CHO培養基購自蘭州百靈生物技術有限公司；G418 購自美國Gibco 公司；電轉染緩沖液、pmaxGFPTMVector購自瑞士Lonza 公司；超濾膜包購自美國PALL 公司；6 周齡雌鼠購自甘肅華瑞祥和生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組FSH 設計及合成 從NCBI 數據庫中獲取綿羊FSH-α（GenBank：NM_001009464.1）和綿羊FSH-β（GenBank：NM_001009798.1）的核苷酸序列。經在線信號肽分析工具分析FSH-β 核苷酸序列中前1-18 位為信號肽，在信號肽序列前加入Kozark 序列用來增強真核基因的翻譯效率，并加入102 bp 的N4（4 個N 連糖基化位點）核苷酸序列作為Linker來連接FSH-β 和FSH-α，同時上游加入酶切位點BamH I，下游加入酶切位點EcoR I，與真核表達載體pcDNA3.1 進行連接，序列設計完成后由南京金斯瑞公司進行密碼子優化并合成重組表達質粒。

1.2.2 重組質粒pcDNA3.1-FSHβα 的酶切、測序鑒定 將重組質粒pcDNA3.1-FSHβα 用BamH I 和EcoR I 限制性內切酶進行雙酶切驗證，酶切體系如下：DEPC H2O 30 μL，10×K buffer 5 μL，BamH I 2.5 μL，EcoR I 2.5 μL，重組質粒10 μL，37℃恒溫水浴中酶切4 h。并將重組質粒經由上海生工進行測序，測序正確后提取高純質粒備用。

1.2.3 重 組 質 粒pcDNA3.1-FSHβα 電 轉 染CHOK1-S2 細胞 采用電轉染法將重組質粒pcDNA3.1-FSHβα 轉染至CHO-K1-S2 細胞中，同期設置對照組，對照質粒為pmaxGFP。平衡階段：將CHO-K1 細胞專用電轉試劑置于室溫平衡30 min；細胞培養板中加入完全培養基，置于37℃培養箱中進行預熱。吸取活力≥95%，密度為2×106個cells/mL 的CHOK1-S2 細胞1 mL 于 900 r/min 離心10 min。于1 支新的EP 管中加入電轉液：82 μL Volume of Nucleofector Solution 和18 μL Volume of Supplement 混勻備用。收集細胞，加入上述混勻的電轉液，輕輕吹打混勻，再加入4 μg 質粒，立即將混合液轉入電轉杯中進行電轉。電轉完成后加入完全培養基，將電轉液和細胞吸至預平衡好的6 孔板中，置于37℃ 5% CO2培養箱中培養，48 h 后使用熒光倒置顯微鏡對細胞進行觀察，并取細胞上清進行ELISA 檢測。

1.2.4 CHO-K1-S2-FSH 單克隆細胞篩選 將細胞以每孔2 000 個接種至96 孔培養板，加入400 μg/mL G418 進行初步篩選。15 d 后觀察，尋找形成細胞群落的孔，并取細胞上清進行ELISA 檢測，將初篩得到的細胞命名為CHO-K1-S2-FSH。之后將初篩后的細胞接種至24 孔培養板，并加入400 μg/mL G418 加壓培養。待視野中細胞匯合度達到約90%后，用不含G418 的培養基稀釋細胞，按1 個細胞每孔接種于96 孔培養板中，第2 天進行觀察，對狀態良好的細胞再次進行加藥篩選。培養7 d左右再次進行觀察，得到單克隆細胞。經ELISA 試劑盒檢測，將FSH 表達量高的細胞進行擴大培養，并凍存。其余孔細胞合為一瓶，進行擴大培養，并凍存。

1.2.5 單克隆細胞的生物反應器培養 將成功篩選得到的FSH 表達量高的單克隆細胞以5×105個/mL的接種量在生物反應器上放大培養，培養總體積為3 L。參數設置為：pH 值7.2，溫度37℃，溶氧40%，轉速160 r/min。白天為自動控制溶氧即dO2保持在40%左右，夜間采取培養液表面通空氣的方法，防止細胞缺氧。在整個培養過程中，每間隔12 h 進行細胞計數，并吸取1 mL 細胞上清液進行ELISA 檢測，測定FSH 濃度，直至檢測到細胞中FSH 表達量開始出現下降趨勢時即可停止培養，并收取細胞上清于-20℃保存。

1.2.6 重組綿羊FSH 蛋白超濾 將10 kD 的膜包安裝在超濾設備上，通入0.1 mol/L 的NaOH 將膜包清洗20 min，然后用純水繼續清洗10 min，通入1.2.5中收取的含有重組綿羊FSH 的上清運行20 min，收集濾過部分與未濾過部分，并做好標記。通入純水清洗10 min，更換為0.1 mol/L NaOH 清洗20 min，最后封住管路，使0.1 mol/L NaOH 充滿整個膜包。

1.2.7 重組綿羊FSH 小鼠試驗 經BLAST 比對本研究設計的重組綿羊FSH 蛋白與小鼠FSH 蛋白的同源性可達85%，因此選擇小鼠對重組綿羊FSH 蛋白的生物活性進行檢測。共分為5 組：200 ng/mL 小鼠FSH 蛋白標準品作為陽性對照組（PC），生理鹽水作為陰性對照組（NC），50 ng/mL 重組綿羊FSH組，100 ng/mL 重組綿羊FSH 組，200 ng/mL 重組綿羊FSH 組。采取皮下多次注射的方法免疫小鼠，注射一次后，間隔48 h 再次進行注射，72 h 后進行眼球采血，收集到的血樣4 000 r/min 離心5 min，獲取血清，用ELISA 試劑盒檢測血清中LH 和孕酮（Progesterone，Pg）含量。隨后解剖獲取小鼠卵巢，于體式顯微鏡下進行拍照并稱重，比較各組之間的差異。

1.2.8 統計學分析 采用GraphPad Prism 5.0 軟件進行統計學處理。試驗數據用均數±標準差（x-±s）表示，采用單因素ANOVAs 進行分析。以P＜0.05為差異有統計學意義（*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001）。

2 結果

2.1 重組表達質粒pcDNA3.1-FSHβα的酶切、測序驗證

重 組 質 粒pcDNA3.1-FSHβα 經 雙 酶 切 鑒 定（BamH I/EcoR I），得到798 bp 的插入片段和5 428 bp 的載體片段，酶切后的目的基因的大小和載體的大小均符合預期（圖1）。測序結果顯示重組質粒pcDNA3.1-FSHβα 與NCBI 數據庫中FSH 的核苷酸序列同源性為100%，說明重組質粒構建成功。

圖1 重組質粒pcDNA3.1-FSHβα 的雙酶切驗證

2.2 重組質粒pcDNA3.1-FSHβα蛋白表達檢測

重組表達質粒pcDNA3.1-FSHβα 電轉染至CHOK1-S2 細胞中，同期設置pmaxGFP 作為對照。轉染48 h 后，使用熒光倒置顯微鏡對試驗組及對照組細胞進行觀察，結果顯示，轉染48 h 后對照組綠色熒光信號很強，表明此次轉染效率達標（圖2），試驗組細胞上清經ELISA 檢測有重組FSH 的表達，表達量為130.16 ng/mL。說明重組表達質粒pcDNA3.1-FSHβα 在CHO-K1-S2 細胞中成功分泌表達。

圖2 轉染48 h 后的CHO-K1-S2 細胞

2.3 CHO-K1-S2-FSH單克隆細胞篩選

使 用400 μg/mL G418 加 壓 篩 選CHO-K1-S2-FSH 單克隆細胞，具體方法見1.2.4，經過篩選得到19 株單克隆細胞，分別命名為M-FSH-βα-B31A7，M-FSH-βα-B31A8，M-FSH-βα-B31B3，M-FSHβα-B31B4，M-FSH-βα-B31B6，M-FSH-βα-B31B8，M-FSH-βα-B31C6，M-FSH-βα-B31C7，M-FSHβα-B31D7，M-FSH-βα-B31E8，M-FSH-βα-B31F6，M-FSH-βα-B31F8，M-FSH-βα-B31G7，M-FSH-βα-B31G10，M-FSH-βα-B32B3，M-FSH-βα-B32B8，M-FSH-βα-B32C2，M-FSH-βα-B32G3（圖3）。并 對單克隆細胞的上清液進行ELISA 檢測（表1），篩選出蛋白高表達的單克隆細胞，最終我們選擇單克隆細胞CHO-K1-S2-FSHβα-B31A4 進行后續試驗。

圖3 單克隆細胞

2.4 單克隆細胞的生物反應器培養

將CHO-K1-S2-FSHβα-B31A4 單克隆細胞進行生物反應器擴大培養，每間隔12 h 測定細胞密度和FSH 濃度，結果見圖4。此次培養周期中，細胞沒有出現泡沫過多和細胞結團的現象，當培養到72 h時，表達的蛋白量出現下降趨勢，此時細胞密度為3.87×106個cells/mL，蛋白表達量為297.97 ng/mL。此時進行收樣，獲取重組綿羊FSH。

表1 單克隆細胞上清中FSH 的ELISA 檢測

圖4 CHO-K1-S2-FSHβα-B31A4 5L 生物反應器培養

2.5 重組綿羊FSH蛋白超濾

對制備的重組綿羊FSH 進行10 kD 膜包超濾，超濾濃縮液進行ELISA 檢測，FSH 濃度為531 ng/mL，提高了1.78 倍，且濃度達到注射濃度。

2.6 重組FSH對小鼠卵巢重量的影響

使用體式顯微鏡對小鼠卵巢進行觀察并拍照（圖5），然后對卵巢進行稱重，試驗組小鼠卵巢重量較陰性對照組明顯增加且差異顯著（圖6），說明注射一定劑量的重組綿羊FSH 蛋白可以促進卵巢生長。

2.7 小鼠孕酮Pg及黃體生成激素LH的ELISA檢測

圖5 小鼠卵巢（10×）

圖6 各組間小鼠卵巢重量

將采集到的各組小鼠血清用孕酮Pg 和黃體生成激素LH 的ELISA 試劑盒分別進行檢測，由結果可知（圖7-A、7-B），注射一定劑量的重組綿羊FSH（FSH 濃度≥50 ng/mL）可以顯著增加小鼠體內孕酮Pg 和黃體生成激素LH 的含量，各試驗組之間不呈劑量依賴性，且與陽性對照組相比差異不顯著。

3 討論

基因工程手段表達FSH 的關鍵是糖基化修飾，FSH 只有經過糖基化修飾才具有生物活性［15］。如果使用原核表達FSH，蛋白能夠成功表達，但是表達產物存在以下幾點問題：（1）表達產物是包涵體，不利于獲取蛋白；（2）在變性和復性過程中，二硫鍵不能全部復原，會影響空間構象；（3）原核生物無糖基化修飾功能。所以FSH 的表達不能選用原核表達，只能選用真核表達系統。人類試管嬰兒技術中，果納芬（Gonal-F）和普麗康（Puregon）是最常見的促排卵藥物，它們均運用了基因工程技術，將促卵泡激素FSH 的基因導入CHO 細胞真核表達系統中進行制備，并且目前上市的大部分復雜蛋白藥物均由CHO 細胞真核表達系統表達［16-19］。在真核表達系統中，表達雙亞基結構的蛋白有兩種方案：（1）將兩種亞基的基因分別構建在兩個載體上進行蛋白的表達；（2）將兩種亞基的基因構建在同一個載體上進行蛋白的表達。果納芬采用的是第一種方案，即將α 亞基基因構建在攜帶DHFR 的表達載體上，β 亞基基因構建在正常表達載體上，然后共轉染至DHFR 缺陷型CHO 細胞中，使用MTX 進行單克隆細胞的篩選，從而篩選出表達量高、遺傳穩定的重組人FSH 表達細胞。普麗康采用的則是第2 種方案，即將α 和β 兩個亞基構建在同一載體pBR327上，該表達載體上攜帶有G418 抗性基因和MT-IIA基因，然后轉染至CHO 細胞后使用G418 進行篩選，從而獲取生產所用的細胞［20］。

圖7 小鼠生殖激素的檢測結果

本研究采用第2 種方案進行重組綿羊FSH 的制備，同時為了增強真核基因的翻譯效率，在信號肽序列前加入Kozark 序列，并用N4 核苷酸序列作為Linker 來連接FSH-β 和FSH-α。構建成功的重組表達質粒電轉至CHO 細胞后，采用G418 加壓篩選獲取了高表達綿羊重組FSH 蛋白的工程細胞。將生物反應器放大培養并超濾濃縮后獲得的重組FSH 免疫小鼠測定其生物活性，結果顯示，當注射重組FSH后，小鼠卵巢重量增加，孕酮和黃體生成素均上調，但是重組FSH 無明顯的濃度依賴性，當濃度大于50 ng/mL 時，重組FSH 已經顯著促進了孕酮和黃體生成素的產生。FSH 一直在動物超數排卵、胚胎移植、繁殖育種和相關疾病治療上有廣闊的應用前景，并且由于目前我國畜用FSH 生產成本極高，因此重組綿羊FSH 將對工業化應用具有重大意義。

4 結論

本研究成功構建了重組質粒pcDNA3.1-FSHβα，并實現其在全懸浮CHO-K1-S2 細胞中分泌表達，經單克隆篩選獲得FSH 表達量高的細胞株，然后利用生物反應器進行擴大培養，收集上清超濾濃縮后獲得重組綿羊FSH；之后將制備的重組綿羊FSH 免疫雌鼠，結果顯示注射重組綿羊FSH 后小鼠卵巢體積增大、重量增加，并且小鼠血清中的黃體生成素LH和孕酮Pg 含量均顯著上調。這些結果均證明重組綿羊FSH 對小鼠具有一定的生物活性。