植物WRKY 轉錄因子家族研究進展

黃幸 丁峰， 彭宏祥 潘介春 何新華，3 徐炯志 李琳

（1. 廣西大學農學院，南寧 530004；2. 廣西壯族自治區農業科學院園藝研究所，南寧 530007；3. 亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004）

轉錄因子是一種具有特殊結構并且能行使調控基因表達功能的蛋白質分子。植物的轉錄因子有2 種，一種是非特異性轉錄因子，它們可以非選擇性地調控基因的轉錄表達，如大麥中的HvCBF2（C-repeat/DRE binding factor 2）［1］；另一種為特異性轉錄因子，它們能夠選擇性調控某種或某些基因的轉錄表達，如WRKY、bHLH、bZIP、MYB、NAC、HMG、HSF、zinc-finger 蛋白、AP2/ERF（乙烯響應因子）等，它們在調控植物的特異性方面發揮著重要而獨特的作用［2-3］。其中WKRY 基因家族是高等植物中最大的轉錄因子家族之一，在整個植物譜系中均有發現。Ishiguro 等［4］從甘薯中克隆出世界上第一個WRKY 基因SPF1（Swet potato factor 1），隨后在多種植物中成功分離鑒定到WRKY 轉錄因子。WRKY 基因家族在進化過程中，從綠藻中的一個或幾個基因，到最早陸生苔蘚中的30 多個基因，再到高等植物中的100 多個基因，顯示了其基因擴張的過程（表1）。

表1 21 種植物的WRKY 家族基因

Rushton 等［5］從 歐 芹 中 鑒 定 出WRKY1、WRKY2 和WRKY3，將其命名為WRKY（發音為“worky”），并首次證明了WRKY 蛋白在調節植物對病原體的反應中起著重要的作用。同時在調控蔗糖（SPF1）或萌發過程（ABF1 和ABF2）基因表達方面也發揮著潛在的作用［4-5］。自2000 年有學者發表了關于WRKY 轉錄因子文章以來，在過去的十幾年里，科學家們對WRKY 蛋白的研究取得了重大進展。以往的研究綜述主要集中在WRKY 轉錄因子在防御反應中的作用，本文將從WRKY 轉錄因子在植物中調控作用、WRKY 蛋白功能機制、涉及WRKY 轉錄因子信號傳遞中自調節和交叉調節的調控網絡以及基于WRKY 基因組測序的基因進化等方面總結植物WRKY 轉錄因子最新研究進展，以便更全面地了解它們在植物中的作用。

1 WRKY 轉錄因子的結構特征與分類

1.1 WRKY轉錄因子的結構特征

WRKY 轉錄因子具有非常顯著的結構特點，其蛋白結構基本含有1-2 個WRKY 結構域（圖1），為DNA 結合域（DBD），約由60 個高度保守的氨基酸殘基組成，包括位于N 端的七肽和位于C 端的鋅指結構。位于N 末端的七肽WRKYGQK 絕對保守，是核心序列，位于C 端的序列由C2H2（C-X4-5-C-X22-23-H-X-H）或C2HC（C-X7-C-X23-H-X-C）型鋅指結構組成［23-25］。WRKY 轉錄因子可通過WRKY 結構域與靶基因啟動子區的順式作用元件TTGAC（C/T）核苷酸序列（W-box）特異性結合，以此激活或抑制轉錄，進而調控下游基因的表達［15，26］。Yamasaki等［27］報道了擬南芥WRKY4 結構域由一個四鏈β 片層組成，在β 片層的C 端由保守的半胱氨酸/組氨酸（Cys/His）殘基形成一個鋅結合袋，WRKYGQK殘基對應于序列的N 端鏈，在序列的中間被Gly 殘基扭折，使得涉及Trp（色氨酸）殘基的廣泛疏水作用，進而促使β 鏈的結構具有穩定性。β 鏈的WRKYGQK 基序可以接觸一個大約6 bp 區域，這在很大程度上與W-box（TTGACY）的長度是一致的。表明WRKYGQK 的基序可以與靶基因啟動子區的W-box 結構特異性結合。

WRKY 轉錄因子的結構域在不同植物中存在多種變異。水稻WRKY 家族成員有19 個WRKY 結構域的變體，其中WRKYGEK 和WRKYGKK 是7 個域和5 個域共有的常見突變體［28］。在中間錦雞兒轉錄組數據鑒定的53 個CiWRKY基因中，CiWRKY 蛋白既含有高度保守的WRKYGQK 基序，同時又包含2 個變異的WRKYGKK 和WKKYEEK 基 序［29］。有研究表明WRKYGQK 序列突變可顯著降低WRKY轉錄因子與DNA 的結合活性［25］。煙草NtWRKY轉錄因子的結構域中，C 端結構域活性較強，而N 端WRKY 結構域與W-box 的結合活性較弱，其C2H2型鋅指狀基序中保守的半胱氨酸和組氨酸殘基被取代，也能使WRKY 轉錄因子與DNA 結合遭到破壞［25］。

除WRKY 結構域之外，WRKY 轉錄因子還包含其他結構域，包括TIR-NBS-LRR（Toll/interleukin-1 receptor-nucleotide binding site-leucine-rich repeat）、激酶結構域、脯氨酸富集區、谷氨酰胺富集區、絲氨酸-蘇氨酸富集區、亮氨酸拉鏈、核定位結構域等［30］。擬南芥AtWRKY7 同時含有一個WRKY 結構域和一個鈣調蛋白CaM 結合結構域［31］。WRKY 轉錄因子多樣的結構域表明，擁有特殊結構的WRKY轉錄因子可以在基因表達調控中發揮重要的特殊功能作用。

1.2 WRKY轉錄因子的分類

從植物中獲得完整的WRKY 基因家族序列之前，Eulgem 等［23］把WRKY 家族成員分為Group I、GroupII 和GroupIII 3 個 亞 家 族。Group I 含 有2 個WRKY 保守結構域，其C 端的鋅指結構為C2H2型；Group II 只含有1 個WRKY 保守結構域，鋅指結構與I類相同，為C2H2型；Group III鋅指結構為C2HC型，包含1 個WRKY 保守結構域（圖1-A）。但也有少部分WRKY 蛋白的結構類型與這3 類特征都不匹配，如AtWRKY10，其結構可能是N 末端的WRKY 保守結構域發生了丟失，只含有1 個WRKY 保守結構域，與Group I 的蛋白結構特征相似但又不一致［24］；如蘋果的WRKY 蛋白C 末端因缺少完整的類似鋅指蛋白結構而被分類為Group IV［13］。Zhang 等［28］認為Eulgem 等對擬南芥WRKY 家族的分類并不完全基于系統發育分析，為了反映WRKY 域的演化過程，通過系統發育分析，WRKY 轉錄因子分為I、IIa+IIb、IIc、IId+IIe 和III，而II 類并不單獨分為一類。隨后，Tamura 等［34］通過純系統發育數據分析也證實了這一點（圖2）。WRKY 轉錄因子的進化分析對理解植物生物多樣性的整體機制，以及WRKY 基因在植物調控網絡中發揮的特殊功能具有重要意義。

圖1 WRKY 結構域［32］

圖2 高等植物WRKY 基因家族系統發育樹［34］

2 WRKY 轉錄因子基因家族的生物學功能

WRKY 轉錄因子家族成員眾多，在植物不同發育時期和多種環境因素誘導下，激活或抑制目的基因表達特定的目的蛋白，發揮著各種非常重要的生物學功能，主要涉及對植物的生長發育和衰老調控、非生物和生物脅迫應答等過程。

2.1 生長發育調控

植物基因組基因的有序表達是植物生長發育的基礎。大量研究表明，WRKY 轉錄因子在不同的組織中發揮非常重要的功能作用，調控植物的生長發育。許多研究已證實WRKY 轉錄因子在植株生長、根系發育、果實成熟、衰老等代謝過程等多種生理過程中的重要作用。

2.1.1 植株生長許多轉錄因子具有調節植物發育和矮化的作用（包括WRKY、AP2/EREBP、bHLH、C2H2 和ARF）。其中，已知最多的是WRKY 家族［35-36］。WRKY 轉錄因子具有誘導植株矮化的作用［37］。OsWRKY11過表達降低了轉基因水稻植株的高度，導致植株矮小［38-39］。矮化表型主要是由于細胞分裂和細胞伸長的變化導致的，這些過程受細胞分裂素（CTK）、生長素（IAA）、赤霉素（GA）和油菜素類固醇（BR）的調控［40］。IAA、CTK 和GA被廣泛認為在植物矮化中具有重要作用［41-42］。另外，BR 在植物矮化中也具有重要作用［40］。在擬南芥中，存在BR 生物合成基因缺陷的cpd、cbb3、dwf4突變體和BR6ox1、BR6ox2雙突變體均表現為矮化表型［43］。Zheng 等［44］研究表明，WRKY 可以直接調控BR 的生物合成。蘋果轉錄因子MdWRKY9 是通過直接抑制油菜素類固醇限制合成酶MdDWF4的轉錄，減少BR 的產生，正向調控植株的矮?。?4］。以上證明WRKY 轉錄因子在調控植物發育和矮化中發揮著重要的作用。

2.1.2 根系發育 據報道WRKY 基因在調節植物激素合成中發揮作用［45-46］。一些WRKY 基因通過影響植物激素信號或基因表達來影響根系結構［47］。與野生型相比，OsWRKY31的過表達導致側根更少更短，這可能是通過干擾生長素的響應或轉運來實現的［47］。

類似的研究表明，OsWRKY28功能缺失突變體可能是通過降低了JA 生物合成基因的表達從而影響根生長［48］。另外，乙烯（ETH）在根系的發育中可誘導根毛和不定根的形成。在小麥試驗中，乙烯合成的1-氨基環丙烯-1-羧酸合酶基因在過表達系TaWRKY51-OE 中下調，而在基因沉默TaWRKY51-RNAi 系中上調，進一步研究發現，TaWRKY51是ETH 合成的負調控因子，TaWRKY51通過與啟動子區存在的W-box 順式元件結合抑制ETH 合成基因ACS的表達，協調小麥乙烯合成和側根形成［49］。說明WRKY 轉錄因子可調節植物的相應的激素合成，然后通過這些植物激素來調控根系的發育。

2.1.3 果實成熟 WRKY 轉錄因子在果實成熟的生理途徑中發揮重要的調控作用。通過表達模式分析顯示，近60%CaWRKY在辣椒成熟過程中表達［50］。ClWRKY在西瓜果實組織中均較高表達［51］。在鱷梨［52］和草莓［53］中也成功篩選到與成熟過程相關的WRKY 轉錄因子，表明其在果實成熟過程中可能發揮一定的調控作用。其中，FaWRKY轉錄因子參與了脫落酸（ABA）的信號通路，通過調控ABA 的合成來促進草莓果實的成熟［53］。

2.1.4 衰老 WRKY 轉錄因子同樣能參與葉片衰老的調控。WRKY 轉錄因子是擬南芥衰老轉錄組中第二大轉錄因子家族［54］。AtWRKY6在衰老過程中明顯上調，通過對AtWRKY6靶基因的分析，確定衰老誘導了受體激酶和受體樣激酶（SIRK/FRK1）基因的表達。SIRK/FRK1編碼一種受體樣蛋白激酶，該蛋白激酶在葉片衰老過程中被強特異性誘導表達［55-56］。在其他物種中，調節衰老的WRKY 基因（包括GhWRKY42、CiWRKY40-4和BrWRKY6）相 繼 得到驗證。如GhWRKY42的過表達導致導致衰老相關基因表達升高，促進了葉片早衰［57］。CiWRKY40-4過表達至擬南芥延緩了葉片衰老，是衰老的負調控因子［29］。WRKY 轉錄因子也可以通過調控植物激素的合成來調控葉片的衰老。GA 可以抑制葉片衰老，而BrWRKY6 通過W-box 順式元件與衰老相關基因BrSAG12、BrNYCl、BrSGR1的啟動子結合，抑制GA 生物合成基因BrKAO2和BrGA20ox2的表達，加速了葉片的衰老［58］。

2.2 參與植物的非生物和生物脅迫調控

植物的生存環境復雜多變，經常遭受非生物因素和生物因素的逆境脅迫，影響植物的生長發育，嚴重會直接造成植物死亡。植物通過基因的表達調控可以抵抗逆境脅迫的侵害，其中WRKY 轉錄因子在植物對逆境脅迫響應過程中的調節具有重要作用。

2.2.1 參與植物的非生物調控 WRKY 是一類鋅指型轉錄因子，主要存在于植物中，它在調節植物的許多非生物應激反應（如干旱、澇漬、高鹽、高溫、低溫、機械損傷、金屬元素等）中起關鍵作用。近年來，發現越來越多的WRKY 基因參與非生物逆境應答，不僅有模式植物煙草和擬南芥，還有水稻、小麥、大豆、玉米、棉花、黃瓜、向日葵、菊花、竹子、葡萄、核桃、野生樹種等多種植物，且大多數已經通過基因過表達或敲除的方式進一步驗證了其在植物非生物脅迫中的調控作用。WRKY 轉錄因子作為干旱、低溫等脅迫應答的主要成分，可與下游基因啟動子中的順式作用元件特異性結合，調節一系列依賴該順式作用元件的抗逆功能基因以特定的強度在特定的時間與空間表達，進而增強植物對干旱、低溫及高鹽等逆境的抗性。目前，越來越多響應非生物脅迫的植物WRKY 基因組序列被鑒定報道（表2）。

2.2.2 參與植物生物脅迫調控 WRKY 轉錄因子的表達受多種環境和內部因子強烈而迅速地誘導，尤其是生物脅迫相關的因子。植物對生物脅迫的反應依賴存在于細胞膜和細胞內部種類繁多的受體蛋白。一般而言，處于細胞膜上的受體通過識別病原菌上保守的特征序列，從而啟動抗性反應。這類保守的特征序列簡稱病原體相關分子模式（Pathogen associated molecular pattern，PAMP），識別這一序列的受體被稱為模式識別受體（Pattern recognition receptor，PRR），其介導的抗性反應稱之為PAMP 觸發的免疫反應（PAMP triggered immunity，PTI）［77-79］。另外，細胞內部的受體蛋白多為NBS（Nucleotide binding site）-LRR（Leucine-rich repeat）類抗病基因所編碼，其直接或間接識別病原菌釋放到細胞內部的效應因子（Effector），啟動抗病反應，這一反應被稱為效應因子觸發性免疫（Effector triggered immunity，ETI）。這兩種反均需要WRKY 轉錄因子介導［77，79］。植物在受到各種微生物或病原體侵害時，通過啟動這些復雜免疫系統來保護自己免受攻擊。近年來，越來越多的WRKY 轉錄因子在這些免疫系統中發揮著重要的調控作用（表3）。

3 WRKY 轉錄因子的轉錄調控機制

3.1 WRKY轉錄因子的轉錄調控機制：轉錄的激活、抑制和去抑制

WRKY 蛋白可以激活或抑制轉錄，通常富含潛在的轉錄激活和抑制域。一些WRKY 因子具有兩種功能。例如，在酵母中，AtWRKY53 根據啟動子上下游序列激活或抑制報告基因的轉錄。AtWRKY6在轉錄激活SIRK 基因（編碼與衰老有關的受體樣蛋白激酶）的同時，負向自調節自身的啟動子［56］。通過瞬時表達研究發現，OsWRKY72和OsWRKY77在糊粉蛋白細胞中是ABA 信號的激活因子，同時又是GA 信號的抑制因子［45］。CaWRKY40b既是自身啟動子的激活因子，也是免疫相關基因HSC70的轉錄的抑制因子［97］。以上表明，WRKY 轉錄因子在多種信號通路中既可以是激活因子，又可以成為抑制因子。

表2 WRKY 轉錄因子在非生物脅迫中的調控作用

3.1.1 轉錄激活 研究表明，許多基因受到與其啟動子相關的WRKY 因子的激活。BhWRKY1與BhGolS1（半乳糖醇合成酶）啟動子的W-box 結合，轉錄激活BhGolS1的表達，可以提高擬南芥的耐旱性［98］。AtWRKY50可以和TGA2或TGA5作用與PR1啟動子的W-box 結合，協同激活PR1 的表達，增強擬南芥的抗性［99］。

MAP 激酶（MAPK）參與調控WRKY 轉錄因子的結合活性。例如，在擬南芥中，MEKK1 蛋白激酶是雙功能蛋白，在擬南芥衰老誘導的信號通路中，它既可以與WRKY53的啟動子在W-box 上游的一個位點（WP1）結合，又可以誘導AtWRKY53轉錄因子磷酸化，促進AtWRKY53轉錄因子和與其自身編碼基因啟動子的結合，調控擬南芥的衰老［100］。MAPK 通過磷酸化激活WRKY46 轉錄因子與PAMP響應基因NHL10啟動子的結合活性，增加NHL10基因的表達，調控擬南芥的對細菌鞭毛蛋白病原體的防御反應［101］。

WRKY 功能的另一種機制是通過小RNA（smRNA）（ 微 小RNA，miRNA 和 小 干 擾RNA，siRNA）起作用，它們已成為調控基因表達的基本模式［102］。由于多個miRNA 的預測靶點編碼WRKY轉錄因子［102］，因此，WRKY 不僅可以調節smRNA的數量，而且WRKY 轉錄因子本身也是smRNA 的靶向因子。

3.1.2 轉錄的抑制和去抑制 除了含有豐富的轉錄激活區，WRKY 轉錄因子還存在重要的轉錄抑制區。大量的證據表明，許多基因被與其啟動子結合的WRKY 因子所抑制。從WRKY 蛋白在抑制中的作用程度可以了解WRKY 的功能。

其中，一種作用方式是靶基因被其他轉錄因子與啟動子的調控位點結合，阻止自身轉錄因子與靶基因啟動子的結合。例如，PcWRKY1可以結合PcPR10基因啟動子的W-box，絲裂原活化蛋白激酶在細胞核中可以修飾已結合的PcWRKY1轉錄因子，這種修飾作用導致PcWRKY1轉錄因子的變構釋放，并可能被其他WRKY 轉錄因子從同源的W-box元件中取代，從而解除對PcPR10和PcWRKY1的抑制［15］。另一種方式是通過作用于其他轉錄因子來抑制其他轉錄因子的作用。例如，bZIP28的轉錄可以上調內質網ER 蛋白基因的表達，對植物的抗病具有積極的作用，但bZIP28啟動子中存在順式作用元件W-box，WRKY7/WRKY11/WRKY17可以通過與bZIP28啟動子中的W-box 元件結合，在轉錄上抑制了bZIP28的上調，使得擬南芥對丁香假單胞細菌的抗性減弱［103］。

表3 WRKY 轉錄因子在生物脅迫中的調控作用

還有一種轉錄抑制方式是通過改變DNA 或組蛋白的高級結構阻止轉錄的發生。如表觀遺傳修飾的DNA 甲基化和去甲基化、組蛋白乙?；腿ヒ阴；?，是誘導應激轉錄關閉或開啟的關鍵機制。DNA甲基化能引起DNA 與蛋白質相互作用方式的改變，從而抑制基因表達。例如，水稻葉片組織中2 種基因WRKY50和WRKY72啟動子上的DNA 甲基化，降低了WRKY50和WRKY72的表達水平［104］。相反，DNA 的去甲基化可以實現WRKY 轉錄因子的去抑制過程，使WRKY 轉錄因子的抑制作用轉為激活作用。DBR2的 啟 動 子 區 在4 個CG-、4 個CHH- 和2 個CHG-位點發生了去甲基化，使得青蒿素生物合成的關鍵調控基因DBR2表達上調，表明WRKY 啟動子上的去甲基化促進了ABI5青蒿素的表達［105］。同樣，組蛋白的去乙?；梢砸种妻D錄因子與DNA 結合位點特異性結合，而組蛋白的乙?；瘎t發揮相反的作用。組蛋白去乙?；?9（HDA19）通過去除組蛋白尾部的乙酰基抑制AtWRKY38和AtWRKY62的轉錄，負調控基底防御［106］。而另外一項乙?；难芯勘砻?，擬南芥WRKY40啟動子上的組蛋白H3K9（組蛋白H3 第9 位賴氨酸）乙酰化，可以增加WRKY40基因的表達，提高擬南芥對鐮刀菌的抗性［107］。以上這些研究表明，通過表觀遺傳修飾的DNA 甲基化和去甲基化、組蛋白乙?；腿ヒ阴；饔茫梢哉T導WRKY 基因轉錄的關閉或開啟。

4 WRKY 轉錄因子的調控網絡

在DNA 水平上，WRKY 轉錄因子通過識別并結合其目標基因中的W-box，識別自身或其他目標基因的啟動子來激活或抑制轉錄，實現調控作用。通過蛋白質-DNA 相互作用，WRKY 蛋白的上游調控因子和下游靶基因之間的相互作用和交叉作用構成了復雜的WRKY 調控網絡。在蛋白質水平上，通過蛋白質-蛋白質的相互作用，包括WRKY 轉錄因子之間與多種調控蛋白的相互作用，共同調控植物的生長發育和響應環境中的各種應激反應。

4.1 WRKY轉錄因子的自調控和交叉調控

WRKY 信號網絡的一個特點是通過WRKY 轉錄因子與其自身啟動子相互作用的自調控和其他WRKY 轉錄因子作用的交叉調控來實現調節，這是通過識別并結合目標基因中的W-box 啟動子來實現的。例如，CaWRKY40b通過直接靶向自身啟動子中的W-box，在轉錄水平上表現出正反饋調控［97］，從而實現了WRKY 轉錄因子的自調控。歐芹的PcWRKY1在啟動子中具有3 個協同作用的W-box 的保守排列［108］，在PAMP 誘導后，PcWRKY1轉錄產物增加［109］，通過染色質免疫沉淀分析顯示，這3 個W-box 是由WRKY 轉錄因子結合的，但PcWRKY1與自身的啟動子結合時PcWRKY1的轉錄下調，表明PcWRKY1啟動子位點的W-box 被其他WRKY 轉錄因子結合激活轉錄［110］?；谏镄畔W和植物啟動子的功能研究發現，許多WRKY 基因啟動子在統計上富集了W-box［111］。例如，在歐芹PcWRKY1中，存在多個W-box，其多個W-box 對轉錄有協同作用［108］；大麥HvWRKY38的轉錄需要2 個相鄰的W-box來有效綁定［112］；水稻2 個OsWRKY45-DBD分子交換β4-β5 鏈形成二聚體，包含2 個與W-box 相互作用的DNA 結合域［113］。WRKY 基因的多個W-box 表明自調節和交叉調節是WRKY 轉錄因子調控網絡的特征。

4.2 WRKY轉錄因子在蛋白水平的調控網絡

盡管WRKY 轉錄因子具有功能多樣性，而且幾乎所有分析的WRKY 蛋白都能識別W-box 序列，但是除了可以識別核心W-box 啟動子元件外，還存在其他機制可以實現WRKY 轉錄因子的特異性調控。例如，WRKY 轉錄因子與多種蛋白相互作用，在信號和轉錄中發揮的調控作用。目前正在研究WRKY的信號網絡和轉錄調控機制，通過蛋白質-蛋白質的相互作用，除了前文提到的鈣調蛋白、MAP 激酶、去乙酰化酶，還有抗性R 蛋白和多種轉錄因子等，揭示WRKY 蛋白的調控功能網絡。

4.2.1 WRKY-MAPK 的相互作用 絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）存在于所有真核生物中，是一個高度保守的模塊。在植物中，MAPK 通路參與調控發育、生長、程序性細胞死亡，以及對多種環境刺激的反應［114］。MAPK 信號級聯通過多個磷酸化作用將上游受體與下游目標連接起來，通過磷酸化放大和轉導膜受體感知到的病原體衍生信號，并將這些信號轉導改變相關的基因表達［115］。

MAPK 信號傳導途徑響應植物的MTI（由識別微生物的保守分子MAMP 引發的免疫）或PTI 防御信號通路反應，植物在免疫反應中通過細胞內的MAPK 級聯信號可以感知到MAMP 和PAMP，并刺激WRKY 轉錄因子的誘導［24］。在擬南芥中，轉錄因子AtWrky33在沒有病原體感染的情況下與MAP 激酶4（MPK4）形成MAMP 或PAMP 復合物。MAMP 或PAMP 復合物被病原體感染激活MEKK1-MKK1/2-MPK4 模塊，激活的MPK4 磷酸化MKS1，導致MPK4-MKS1-Wrky33 復合物的核離解，MKS1和AtWrky33被釋放，激活PAD3（合成抗菌復合物所需的酶）的表達，提高了擬南芥的抗病性［116］。隨后一項研究中，通過磷蛋白遷移轉移試驗，表明AtWrky33可以被MPK3/MPK6 磷酸化，并促進AtWrky33調控植物抗毒素的生物合成［117］。相反，WRKY34中MPK3/MPK6 磷酸化位點的缺失影響了WRKY34在體內的功能［118］。OsWRKY53作為MPK3/MPK6 的負反饋調節器發揮作用，從而起到誘導防御的早期抑制作用［119］。由MPK3/MPK6、Wrky33、類AGD2 防御反應蛋白1（ALD1）和哌啶酸（PiP）組成的正調控環存在于系統獲得性抗性（SAR）誘導過程中，推測在PiP 生物合成水平上存在不同的SAR 激活途徑［120］。

4.2.2 WRKY-抗性R 蛋白的相互作用 植物防御信號通路的ETI 是基于抗性R 蛋白對效應蛋白的識別而產生的特異性抗性。當病原菌入侵植物后，植物分泌抗性R 蛋白識別病原菌效應蛋白，WRKY 轉錄因子和抗性R 蛋白互作形成蛋白復合體，解除對基本防御途徑的抑制作用［121］。在大麥對白粉病的免疫中，涉及ETI 免疫途徑，細胞質中的抗病R 蛋白MLA 能夠識別白粉病效應子AVR10，并在細胞核中與HvWRKY1和HvWRKY2結合，解除HvWRKY1/2對抗病的抑制作用，從而達到抗病目的［122］。研究發現，細胞內存在一種典型的嵌合蛋白，如R 蛋白NBSLRR 和WRKY 轉錄因子嵌合而成的組合蛋白，其在免疫調控中發揮著重要的作用。例如，WRKY 轉錄因子與RRS1（一種NBS-LRR 蛋白）相互作用形成的嵌合蛋白AtWRKY52/RRS1，通過與細菌效應體PopP2 的相互作用對細菌致病菌產生免疫［123-124］。擬南芥的RRS1-R、RPS4 蛋白與WRKY 轉錄因子結合形成受體復合物，該復合物可以識別細菌效應因子AvrRps4 或PopP2，然后激活防御系統［121］。以上研究證明，WRKY 轉錄因子通過與抗病R 蛋白結合，識別病原微生物產生的效應蛋白，引發植物產生特異性的防衛反應，在ETI 免疫系統中發揮著重要的調控作用。

4.2.3 WRKY 與多種轉錄因子的相互作用 蛋白質，尤其是調節蛋白，很少單獨起作用，通常情況下，它們在生理上或短暫或永久地相互作用，以承擔生命系統中的生物功能。例如，WRKY 轉錄因子可以與多種轉錄因子相互作用，共同對植物的生長發育進行調控。AtWRKY50可以和TGA2 或TGA5 作用與PR1 啟動子結合，與TGA 轉錄因子協同激活PR1 的表達［99］。VviWRKY03通過與VviMYB14轉錄因子的組合效應發揮作用，共同激活VviSTS29啟動子，調控白藜蘆醇生物合成［125］。除了可以與其他家族的轉錄因子結合，WRKY 轉錄因子還可以與自身家族中其他轉錄因子相互結合，發揮相應的調控作用。WRKY 轉錄因子在結合DNA 前可以通過蛋白質-蛋白質相互作用形成二聚體或多聚體。例如，在病原菌感染過程中，OsWRKY45可與OsWRKY62形成異二聚體，該二聚體可激活DPF基因（二萜植物抗毒素生物合成基因）的轉錄［114］。同時，WRKY轉錄因子還可以與自身形成二聚體發揮作用，例如，激活蛋白復合物WRKY60-60 引發干旱防御反應的可能性較高，轉錄因子WRKY40 和蛋白復合物WRKY40-40 可以抑制干旱反應［126］。

4.2.4 WRKY 轉錄因子與其他蛋白的相互作用 除了前文提到的許多重要的調控蛋白，還存在其他一些蛋白與WRKY 轉錄因子相互作用發揮調控作用。VQ 蛋白是植物特異性轉錄調控的一種輔助因子。VQ 蛋白與WRKY 蛋白的相互作用可能導致構象的改變或翻譯后的修飾，從而激活或抑制它們與靶基因啟動子的結合［127］。在甜瓜中，共有24 個WRKY基因與11 個VQ 家族基因共表達［128］。進一步研究發現，擬南芥VQ10 和WRKY8 可在植物細胞核中形成復合物。WRKY8 的中間區域與VQ10 之間的相互作用促進了WRKY8 與DNA 結合的活性，并正向調節植物對灰霉病菌的抗性［129］。最近研究表明，OsWRKY45的N 端與細胞核中Pb1（穗芽抗性基因）蛋白的N 端螺旋結構域（CC）相互作用對稻瘟菌產生抗性［114］。目前已經發現了大量與WRKY 相互作用的蛋白質，未來在已鑒定出的WRKY 相互作用蛋白的基礎上，預計將會有更多的WRKY 相互作用蛋白被傳統的方法（如酵母雙雜交）和最近發展的方法（如高密度蛋白質微陣列）所識別，并通過其相互作用蛋白在不同水平上的相互作用完善WRKY 轉錄因子復雜調控功能網絡。

5 展望

WRKY 轉錄因子在調控植物生長發育和衰老、非生物及生物脅迫中發揮著重要的作用。隨著高通量轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學等技術的發展，更深入地發掘WRKY 轉錄因子生物學功能，更詳細地確定WRKY 靶基因、WRKY 調控網絡、WRKY 轉錄因子相互作用的蛋白，為探索WRKY 轉錄因子如何在啟動子上發揮信號協同和信號拮抗的作用奠定生物化學基礎，從而幫助人們深入了解WRKY 轉錄因子之間的串擾機制，但要詳細地明確這一機制還需要做更深入的研究。

WRKY 轉錄因子在植物中是一個龐大的基因家族，WRKY 轉錄因子種類繁多，其在調節重要的生物學功能的分子機制和功能多樣性仍然還需進一步的研究和證明，其中一個重要的研究思路是將越來越多的測序數據與蛋白質-DNA 和蛋白質-蛋白質相互作用的信息整合在WRKY 介導的調控重要生物學功能的過程中，建立一個全面的WRKY 信號和轉錄調控網絡。在充分了解WRKY 在分子水平上的作用機制后，通過分子輔助育種和生物技術工具，培育出達到經濟目的的優良品種。