衍生化HPLC/MS法測定有機羧酸物質的研究進展

張晨曦，盧愛玉，薛揚睿，孫崟喆，江弦，許風國，焦宇

(中國藥科大學理學院，江蘇 南京 211198)

小分子羧酸廣泛存在于人體的糖代謝、氨基酸代謝等生命過程中是一類有重要生物學意義的分子。研究表明大約8%的待檢測物質都包含羧酸官能團[1]。因此，靈敏且選擇性高的羧酸化合物檢測方法對于闡明這些羧酸化合物在生命系統中的功能和機制非常重要。

近年來小分子羧酸的檢測主要依靠液相-質譜聯用技術(LC-MS),特別是配備電噴霧離子源(ESI)的LC-MS/MS。然而使用ESI-MS檢測羧酸類物質也面臨著許多挑戰。盡管羧酸類物質在負ESI-MS中可被檢測到，但由于高背景噪聲，檢測的靈敏度并不理想。此外用于分離羧酸的流動相并不總是與ESI-MS兼容，這也限制了LC-MS對于羧酸的檢測。

近年來化學衍生化法越來越多地應用于各種難檢物質的檢測，日益受到人們的關注。化學衍生化法是指通過化學反應將待測分子接上某種特定衍生化基團,從而改變化合物特性使其更適合于特定分析的過程。在LC-MS檢測中應用化學衍生化法可以通過引入不同的衍生化基團使待測物更易被檢出。

衍生化法常用的反應有酯化、酰化、烷基化、硅烷化、硼烷化、環化和離子化等，衍生化能夠抑制樣本碎片化，提高樣本的揮發性和穩定性。將LC-MS與衍生化結合，可以提高LC-MS的分析能力，增大敏感度，彌補二者的不足。柱前衍生化法是LC-MS衍生化中最為重要的一種，其主要在色譜分離前預先將樣品制為適當的衍生物，然后再進入色譜柱進行分離檢測[2]。該方法可以使待測組分與衍生化試劑有選擇性的反應，改變其出峰順序而使其與樣品中其他組分分離開，也可以使被測組分接上帶有發色集團的衍生化試劑使本來不能被檢測的組分得以被檢測。

根據衍生化原理的不同,羧酸物質柱前衍生化方法可以分為：通過形成酰胺鍵進行衍生化和通過其他化學鍵進行衍生化。

1 通過形成酰胺鍵進行衍生化

Tatsuya Higashi在2012年開發了一種靈敏且選擇性好的衍生化試劑1-[(4-二甲基氨基苯基)羰基]哌嗪(DAPPZ)，通過LC/ESI-MS/MS 的方式來檢測非結合膽汁酸(BAs)在鼠腦中的含量。非結合膽汁酸中包含3種組分，脫氧膽酸(deoxycholic acid,DCA)、膽酸(cholic acid,CA)、鵝脫氧膽酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)。然而實際檢測中，非結合膽汁酸在去質子化分子的碰撞誘導下不能解離產生特征性的離子，很難用LC/MS直接檢測。Tatsuya Higashi使用的DAPPZ含有高活性ESI部分，在室溫下它的哌嗪部分可以定量地與羧酸反應，形成酰胺鍵，見圖1[3]。產物在ESI檢測器上易被完全離子化，特征性離子可以被MS/MS準確檢測出。實驗結果表明利用DAPPZ的衍生化使CDCA的檢測靈敏度提高了近75倍。

圖1 BAs與DAPPZ的反應

在實際研究過程中，Shoujiro Ogawa 采用了一種全新合成的反應物N-(2-氨乙基)-4-(二乙胺基)苯甲酰胺(ADB)及其氘代類似物d-ADB為衍生化試劑，測定對羥基肉桂酸(HCAs)和水楊酸(HBAs)兩種防氧化植物素含量。相比于常用的衍生化試劑DAPPZ，ADB和dADB的質子親和力更高，衍生化后的檢測靈敏度是使用DAPPZ時的2倍。在驗證發酵后的大米在防治癌癥方面的效果，及其中有效成分HCAs和HBAs兩種防氧化植物素含量時，應用成果顯著。為了驗證食物中含有更多的HCAs和HBAs對人體健康有益，Shoujiro Ogawa采用ADB及d-ADB為衍生化試劑，與HCAs和HBAs在60 ℃下反應30 min，生成酰胺鍵[4]，見圖2。該方法使這兩種防氧化植物素在LC/ESI-MS/MS檢測中變得既靈敏又準確。

圖2 HCAs和HBAs與ADB或dADB的反應

Takahiro Takayama課題組在2014年開發了(S)-1-4，6-二甲氧基-(1,3,5-三嗪)-2-吡咯烷基-3-胺(DMT-1(S)-Apy)和(S)-4，6-二甲氧基-N-吡咯烷基-3-(1,3,5-三嗪)-2-胺(DMT-3(S)-Apy)衍生化試劑，為代謝組學方面的研究提供了新的思路。代謝組學研究對認知理解生理功能具有重要意義，代謝產物的濃度差異能夠準確地反映身體狀況，很多成熟的試劑已經被廣泛使用。當機體患有某些疾病時，一些手性代謝產物的含量會發生明顯變化。例如當機體患有精神分裂癥或抑郁癥時，與N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體功能有關的D-血清和D-丙氨酸的含量會增加[5]，但是檢測信號的變化幅度并不大。Takahiro Takayama團隊使用DMT-1(S)-Apy或DMT-3(S)-Apy作為衍生化試劑與羧酸類物質反應后(見圖3)，檢測信號可以增強67%，更容易判斷這兩種物質的含量變化，進而有助于醫生對相關疾病做出診斷。

Tatsuya Higashi課題組在2015年開發了一種以(S)-阿納巴辛(ANA)作為衍生試劑在LC/ESI-MS/MS中檢出手性羧酸，并將其對映體分離的方法(見圖4)。他們發現之前單純地利用LC/ESI-MS/MS進行分離速度比較慢，靈敏度不夠高,分離效果也不好。ANA在4-(4，6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-酰基)-4-甲基嗎啉存在下，與羧酸[3-羥基吡啶酸(3-OH-PA)，2-(-羧乙基-6-羥基三甲基色曼(γ-CEHC)]和依托多酸反應迅速，形成酰胺鍵[6]。結果表明，ANA-衍生物在ESI-MS正離子模式具能高度響應，在MS/MS中產生特征產物離子，從而可以通過選擇性的反應監測進行靈敏的檢測。ANA-衍生物的測定響應比全羧酸提高了20～160倍，檢出限在低濃度微孔范圍(1.8～11 fmol)。

圖3 羧酸類物質與DMT-1(S)-Apy或DMT-3(S)-Apy的反應

圖4 手型羧酸與ANA的反應

Shoujiro Ogawa課題組還開發了一種新的衍生化試劑(S)-1-(4-二甲氨基苯基羰基)-3-氨基吡啶(1-DADAP)對手性羧酸在LC/MS中檢出和分離(見圖5)。不同于衍生化前的低靈敏度，低分離效果，1-DAPAP在4-(4，6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-酰基)-4-甲基嗎啉存在下，與羧酸在室溫下反應5 min。所得衍生物含有酰胺鍵，它在ESI-MS正離子模式下響應劇烈，在MS/MS中產生特征產物離子，使選擇性反應監測的靈敏度提高。1-DAPAP-衍生物的檢測響應比完整的羧酸在柱上提高10～1 100倍，檢測范圍分別為0.97 fmol。

圖5 手型羧酸與1-DADAP的反應

利用ANA和1-DAPAP衍生化對手性羧酸的拆分都是有效的。尤其是1-DAPAP的衍生化對羧酸的拆分值為1.243，該衍生化方法能夠成功地應用于生物樣品分析。在實際應用中，經過衍生化后，人唾液中微量布洛芬和萘普生可以在LC/ESI-MS/MS得到很好的分離和檢測，并且具有操作簡單，樣品用量小而靈敏度高的優點[7]。

Noortje de Haan的課題組在2015年使用羧酸活化劑二甲基胺(EDC)為衍生化試劑對唾液酸進行鑒別和定量。人的唾液是一種反應個體生理狀態是否出現異常的重要生物樣本。連鎖特異性唾液酸衍生法(唾液酸糖基化)則是對翻譯前后蛋白質進行修飾的方法，能夠明顯改變蛋白質構象，增大溶解度。但是，糖基化反應進行的程度往往不盡人意，于是Noortje de Haan使用EDC在60 ℃的條件下使唾液酸內酯化和二甲酰化(見圖6)，產物在MS中的響應提高1～2倍[8]。該方法對樣品中唾液酸實現了更靈敏的分析,為臨床醫療提供了具有特異性的糖基化治療性抗體。

Bryce J.Marquis帶領的團隊于2017年設計了一種新型有效的衍生化試劑：4-溴-N-甲基芐胺(4-BNMA)(見圖7)。4-BNMA是一種在生物體內普遍存在的新型高效液相色譜-生物有機酸衍生化試劑，它含有羧酸官能團小分子，用于衍生單羧酸，二羧酸和三羧酸，研究三羧酸循環(TCA)[9]。使用4-BNMA后的6 min內，原羧酸濃度在0.2～44 μg之間的檢測限可以提高2～3倍。該方法已成功應用于體內外模型。

2 通過其他化學鍵進行衍生化

Tao Ma課題組在2015年開發了一種衍生化試劑2-(5-苯并吖啶)乙基-對甲苯磺酸酯[10](BAETS)用來測定藥材中三萜酸的含量。通過RP-HPLC-FLD-MS柱前衍生化法使用這種試劑可以同時測定5種三萜酸：積雪草酸、山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和樺木酸。這個方法有利于更好地鑒定化學成分(見圖8)。

圖6 唾液酸與EPC的反應

圖7 羧酸類物質與4-BNMA的反應

圖8 三萜酸與BAETS的反應

Xian-En Zhao課題組在2016年設計了衍生化試劑 4-羰基氯羅沙明(CCR)來分析神經遞質(NTs)的含量。NTs可能在神經退行性疾病如阿爾茨海默病(AD)中發揮重要作用。為了研究它與疾病間潛在的聯系，Xian-En Zhao 開發了一個新的簡單、快速、準確基于原位超聲輔助衍生化分散的靈敏分析方法。將液-液微萃取(原位UA-DDLLME)與UPLC-MS / MS相結合，用此方法成功進行了AD大鼠尿液中的氨基酸神經遞質(AANT)和單胺神經遞質(MANTs)的定量分析(見圖9)。因為未經衍生化處理的NTs存在于生物樣品中濃度低，化學性質不穩定，并且還存在共洗脫的潛在色譜干擾。所以在一個步驟中同時進行衍生化和分析物的微萃取可以簡化分析樣品提取步驟，減少樣品和溶劑的消耗，提高靈敏度。這是一種在以前沒有用于生物樣品中NTs的分析手段。CCR用于分析NTs時有衍生條件溫和，易于處理和檢測靈敏度高等優點[11]。這種方法可能是阿爾茨海默病(AD)客觀診斷的有效工具并且有益于進一步的神經疾病研究。

圖9 NTs與CCR的反應

Chao Guo課題組在2018年設計出一種新衍生化試劑N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亞胺直接量化體液中痕量生物學上重要的羧基化合物。這個創新性的方法可以檢測許多羧酸類物質如：α-硫辛酸,2-(β-羧乙基)-6-羥基-2,7,8-三甲基苯并二氫吡喃，前列腺素E2，膽堿酸和唾液中的鵝去氧膽酸。該方法包括兩個步驟：首先用N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亞胺對目標分析物衍生化，然后進行HPLC-MS分析見圖10，在實際應用中可以檢測到低皮克每毫升水平[12]。

圖10 羧酸類物質與N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亞胺的反應

Uutela課題組在2019年發現以氯甲酸正丁酯作為衍生化試劑能夠顯著提高氨基酸檢測的靈敏度。眾所周知，氨基酸在食物、植物、生物樣本中廣泛存在，十分重要，并且也是一種有機羧酸。我們常用LC-MS/MS方法對氨基酸進行分析，柱前衍生化則有利于它的監測和分離。氨基酸衍生化的方法大概分為3種，即氨基參與反應，羧基參與反應和兩者同時參與反應。Uutela 對比了3種氨基酸的衍生化試劑，氯甲酸-9-芴甲酯(與氨基反應)、丁醇(與羧基反應)、氯甲酸正丙酯(與氨基和羧基發生反應)見圖11。發現后者與氨基酸反應既生成酯鍵又生成磺酰胺鍵衍生化效果最好[13]，在LC-MS/MS檢測中敏感準確。

圖11 氨基酸與氯甲酸正丁酯的反應

3 總結

在基于化學衍生化的色譜技術中有一些突出的特點:①衍生化反應快速高效且具有生物兼容性；②衍生化反應具有專一性,能夠抑制碎片化，提高樣本的揮發性和穩定性。且MS/MS碎片信息豐富；③可以同時進行衍生化和分析物的微萃取，簡化分析樣品提取步驟，減少樣品和溶劑的消耗，提高靈敏度；④擴大檢測限，增強分析物穩定。

柱前衍生化法具有很多優點,但是由于有些化合物經過衍生化后,有時會得到不止一種反應產物,因此每一個衍生反應的樣品組分會有兩個或更多的色譜峰,從而使色譜圖復雜化,使得柱前衍生化法的使用受到一定的限制。對于種種方面，排除其他干擾，可以改良試劑，調整運行參數進行改良，同時，尋找更多符合衍生化試劑，提高靈敏度尤為重要。

4 展望

羧酸類物質在藥學和生物醫學的研究中十分常見，開發靈敏和有選擇性的痕量化合物測定方法對于闡明它們在生命系統中的生物學作用和功能十分重要。近年來LC-MS常用于此目的，在之前的實驗中證實了有許多最初應用在紫外和熒光檢測中的有潛力的衍生化試劑，如今也可以被應用于LC-MS/MS分析中。并且也有許多全新的衍生化試劑專門為MS/MS 檢測而設計合成。在未來，會有更多高選擇性，敏感度的衍生化試劑被開發應用于羧酸類物質的LC-MS/MS檢測分析中。