聚乙烯亞胺非病毒基因載體結構修飾研究進展

林浩，何東升，涂家生

(中國藥科大學藥學院，江蘇 南京 210009)

基因治療(gene therapy)是指利用外源基因定向地糾正或補償有缺陷的功能基因，從而恢復細胞的正常功能，達到治愈疾病的目的。近年來，隨著眾多用于治療惡性腫瘤的病毒和非病毒載體以及靶向遞送策略的不斷涌現，基因治療迅速成為基礎及臨床癌癥研究領域中人們關注的熱點[1-2]。2003年，我國首先批準了重組人p53腺病毒注射液(商品名：今又生)；歐洲藥品管理局(European Medicines Agency，EMA)于2012年批準Glybera，用于治療脂蛋白脂酶缺乏遺傳病；2018年，人類歷史上首款RNAi療法Patisiran誕生。迄今為止，已經有超過2 500項基因治療臨床試驗在世界各地開展[3]。

由于基因藥物自身帶負電荷很難穿過生物膜，并且易被核酸酶降解，難以準確到達作用部位發揮治療作用。因此，尋找安全有效的基因遞送載體是基因治療的關鍵。基因遞送載體包括病毒載體和非病毒載體。其中，病毒載體具有較高的轉染能力，但存在免疫原性和潛在的安全性問題，且病毒載體容量有限，這一系列問題阻礙了其在臨床基因治療中的應用[4-5]。非病毒載體主要包括陽離子脂質體、陽離子聚合物等，相比于病毒載體，非病毒載體具有成本低、制備簡單、便于大規模生產、安全性高和化學結構可控等優點，越來越受到研究者的關注。

為了實現基因的高效胞內遞送，非病毒基因載體需要具有多重功能以克服遞送過程中的諸多挑戰，如圖1所示。載體首先需要能夠有效包載被遞送的基因，形成穩定的復合物。所形成的復合物應具有合適的粒徑和電位，在體內能循環較長時間，以實現在靶組織的富集。再進一步通過受體介導或是非特異性的內吞進入細胞后，復合物必須從胞內體中逃逸，并根據治療的需要，轉運至作用部位，釋放出所攜帶的基因以發揮作用[6-7]。

圖1 核酸復合物遞送過程及其障礙

非病毒基因載體中，陽離子聚合物聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)大致分為兩種類型，即線性PEI(linear polyethyleneimine，LPEI)和支化PEI(branched polyethyleneimine，BPEI)，結構式如圖2所示，由于其擁有與DNA分子較強的組裝能力而備受關注，其中25 kDa支化PEI(25 kDa BPEI)和22 kDa線性PEI(22 kDa LPEI)在目前的基因載體領域被稱作“黃金標準”[8-9]。PEI于1995年由Boussif等[10]首次報道能夠將DNA轉移到新生小鼠的腦中，證明其在體內的應用。PEI的仲胺叔胺基團能在中性環境中質子化，高電荷密度在其體內外基因轉染過程中起到重要作用，此外，由于PEI具有良好的pH緩沖能力，使其成為最經典有效的非病毒聚合物基因載體之一。 “質子海綿效應”假設給出，PEI復合物通過內吞作用進入細胞，隨后其在酸性囊泡中積累，晚期形成溶酶體，載體緩沖溶酶體pH值的降低，吸收H+，同時為了達到電荷平衡和濃度平衡，引起Cl-和水內流，導致溶酶體滲透性腫脹破裂，復合物從中逃逸出來進入細胞質(見圖3)。PEI通過這種獨特的方式保護了核酸免于溶酶體降解而提高其轉染效率[11]。PEI作為基因載體具有獨特的優勢，但其仍然存在一些缺點，如隨著PEI分子量增加，其基因轉染效率得到提高，但其毒性也隨之增加。高分子量PEI表面帶有較高的電荷密度，可以較好地壓縮、保護DNA/RNA，同時，其良好的質子緩沖能力可促進復合物的溶酶體逃逸，但很難平衡細胞毒性問題，這在一定程度上限制了其應用。低分子量 PEI 細胞毒性雖然較低，但其轉染效率也隨之降低，不能起到很好的轉染效果。為了克服這些限制，研究者對PEI進行了不同類型的結構改造并取得了諸多進展，本文對其研究進展做如下綜述。

圖2 支化PEI (BPEI)和線性PEI (LPEI) 結構式

圖3 PEI憑借質子海綿效應躲避溶酶體降解的機制示意圖

1 多糖修飾的PEI

天然多糖，如殼聚糖、環糊精、甘露糖和普魯蘭糖等，可通過PEI上的寡胺殘基連接得到一系列可生物降解的聚合物，實現高效轉染、靶向遞送和降低毒性等目的。

殼聚糖(chitosan，CS)具有低毒性、生物降解性和生物相容性等優點，然而殼聚糖的低轉染能力限制了其應用，通過將殼聚糖接枝PEI，可以有效地實現基因轉染。Liu等[12]先通過殼聚糖(CS)堿化和羧甲基化反應制備羧甲基殼聚糖(CMCS)，再將PEI通過酰胺化反應接枝到CMCS的骨架上。結果表明與25 kDa PEI相比，CMCS-PEI共聚物與DNA形成的復合物在293T和3T3細胞中具有更低的細胞毒性和更高的轉染效率。

環糊精(cyclodextrin，CD)是一種環狀低聚糖，生物相容性好，在水溶液中可通過其特有的疏水腔與多種藥物結合，廣泛用于納米藥物載體的構建。Jung等[13]將低分子量PEI(low molecular weight PEI，LMWPEI)與甲基β-環糊精(MβCD)交聯形成MβCD-LMWPEI(MLP)，在無血清環境中，MLP可有效轉染腦膠質瘤、黑色素瘤和肝癌細胞，且在血清存在下維持高轉染效率。體外實驗表明MLP具有可忽略的細胞毒性。 Pin等[14]分別合成ε-聚賴氨酸接枝-琥珀酸-接枝的β環糊精-PEI(epsilon-polylysine-grafted-succinic acid-grafted-β-cyclodextrin-LMW PEI，PPC)和金剛烷官能化的聚乙二醇衍生物[adamantane-functionalized poly-(ethylene glycol) derivative，PEG-AD]，PEG-AD被包裹在PPC中以形成復合物。該復合物能夠與pDNA形成粒徑小于200 nm的納米顆粒，而且在不降低轉染效率的情況下，復合物的細胞毒性低于支鏈PEI。

用甘露糖修飾PEI，如直接甘露糖化的PEI[15]、甘露糖化PEI偶聯介孔二氧化硅納米粒[16]和甘露糖基化殼聚糖接枝PEI[17]等，通過靶向甘露糖受體，可增強轉染效率和免疫原性。Ke等[18]報道了一種氨基甲酸酯-甘露糖修飾的PEI(carbamate-mannose modified PEI,CMP)作為基因載體，該載體可將NF-κB(nuclear factor kappa-B)shRNA遞送至目標腫瘤干細胞。結果顯示CMP/對照shRNA納米復合物在4T1鼠乳腺癌細胞中比未修飾的PEI/對照shRNA納米復合物具有更低的細胞毒性和更高的轉染效率。甘露糖修飾后的載體還被應用于光動力療法和基因治療的聯合治療中，以靶向癌細胞和腫瘤相關的巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAM)，Chitgupi等[19]將PEI與光敏劑焦脫鎂葉綠酸-α連接，并對其磺化以靶向凝集素表達細胞和甘露糖基化以靶向TAM，在凝集素和甘露糖受體表達細胞系中，表現出靶向性和治療作用，經過這種修飾改性后的聚合物不僅提高了基因轉染效率，還降低了細胞毒性。

普魯蘭糖因其良好的生物相容性被廣泛應用于靶向藥物和基因遞送等領域。Wang等[20]通過將低分子量支鏈PEI接枝到琥珀酰化普魯蘭糖上合成非靶向基因載體P-PEI(Pullulan-PEI)，進一步將葉酸(folic acid，FA)的羧基與PEI的氨基偶聯來合成靶向基因載體P-PEI-FA，與PEI/pDNA相比，P-PEI/pDNA和P-PEI-FA/pDNA對不同細胞均有較低的細胞毒性；在含血清條件下，與Lipofamine 2000/pDNA和Lipofamine 2000/siRNA相比，P/PEI-FA/DNA在N/P比為6.25時顯示出更高的基因轉染效率，而P-PEI-FA/siRNA在N/P比12.5時表現出更好的基因沉默效果。

多糖直接修飾PEI得到的聚合物不但改善了PEI的生物相容性，而且在一定程度上提高其轉染效率。此外，還可連接一些靶向基團，提高其靶向性和轉染效率，增強治療效果。

2 PEG修飾的PEI

用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修飾PEI后，可以屏蔽多余正電荷，減小PEI毒性。由于親水性PEG鏈段的空間排斥效應，還可以提高復合物的穩定性，防止聚結，延長載體/基因復合物在血液中的循環時間，從而有利于復合物到達靶組織靶細胞，使載體具有更好的生物相容性和更高的轉染效率[21-24]。研究發現[25]，PEG化程度和PEG的分子量顯著影響PEG-PEI的性質，25 kDa PEI經高PEG化程度和低PEG鏈長度修飾后可降低在肺細胞中的細胞毒性以及氧化應激反應。此外，通過PEG連接靶向配體，如葉酸、RGD肽、轉鐵蛋白、抗體、適體和多糖如半乳糖[26]，可實現主動靶向遞送。

Saqafi等[27]將PEI和PEG3500連接，然后將抗HER2的納米抗體(Nbs)共價連接得到PEI-PEG-Nb免疫偶聯物。結果顯示，PEI聚合物與pDNA形成的復合物具有合適的粒徑(123.4±7.4)nm和zeta電位(+4.2±1.8) mV。使用Nb-修飾的復合物在HER2陽性細胞系中轉染效率高于未修飾的復合物，且與傳統PEI聚合物相比，在兩種HER2陽性細胞系中，PEI-PEG-Nb/pGL4.50的轉染效率分別提高了1.6倍和4.8倍。

載有DNA納米顆粒的多孔水凝膠也經常被用于基因遞送領域。然而，在水凝膠內，載有DNA的高濃度復合物會聚集而影響其有效釋放。為了減少多孔凝膠中DNA復合物聚集，Siegman等[28]利用PEG修飾PEI制備sPEG-PEI以減輕膠凝期間聚合物和骨架之間的電荷-電荷相互作用，與線性PEI(LPEI)聚合物相比，sPEG-PEI聚合物形成的復合物毒性更小且更穩定，其在透明質酸(hyaluronic acid，HA)凝膠內表現出更少的聚集。此外，sPEG-PEI復合物保留了與LPEI相當的轉染能力。以上結果表明以PEG修飾PEI可以顯著改善基于水凝膠支架介導的基因遞送，并且在多基因遞送系統的應用中顯示出極好的前景。

3 低分子PEI衍生物

低分子PEI盡管毒性較小，但其較低的基因轉染效率限制了其作為基因載體的應用。因此，通過對低分子量PEI的修飾，提高基因轉染效率同時保持較低的細胞毒性也是目前研究的熱點。

Fatemeh等[29]通過琥珀酸交聯低分子量PEI，在保持其低毒性的同時提高轉染效率。改性修飾的PEI能夠壓縮編碼CD200(一種膜糖蛋白)的質粒DNA形成大小約為130 nm的復合物，在載體與質粒的比例為8時，CD200的表達水平最高，在體外神經退行性疾病模型SH-SY5Y細胞系中的表達增加了1.5倍。此外，體內成像結果顯示納米粒能穿過血腦屏障并進入腦室周圍區域。

Pan等[30]合成了低分子量聚乙烯亞胺和聚噻吩的陽離子共聚物作為siRNA遞送載體，聚噻吩的疏水性和剛性可以增強siRNA跨細胞膜和內體膜的轉運，共聚物和siRNA之間形成的納米復合物即使在摩爾比為1∶2時也能保持穩定，A549-luc細胞(穩轉熒光素酶的人肺癌細胞)中的體外熒光素酶沉默實驗證明，疏水性更強的共聚物/siRNA復合物實現了高效沉默且沒有顯著細胞毒性。

Johnson等[31]報道了氟化碳修飾的聚乙烯亞胺(PEI)用于siRNA遞送，用不同長度的氟碳環氧化物官能化低分子量PEI，氟化碳修飾的化合物均能在體外誘導有效的基因沉默；與烴類似物相比，氟化碳修飾的載體除了具有極強的疏水性之外，還表現出疏脂性，結果顯示其具有更高的細胞攝取和沉默能力。

此外，在PEI的基礎上，為了實現高效安全的基因遞送，Wagner E課題組創新的提出了一系列含有PEI片段序列的人工氨基酸片段[glutaryltriethylene tetramine(Gtt),glutaryl-tetraethylene pentamine(Gtp),succinoyltetraethylene pentamine(Stp)和succinoyl-pentaethylene hexamine(Sph)]，這些人工氨基酸片段能以固相多肽合成的方法來構建系列多肽類似化合物。與PEI相比，保留了可質子化的序列提供正電荷和帶負電的核酸發生靜電吸附形成復合物，并促進胞內體逃逸過程。同時，這類化合物具有多肽的特性，各片段間通過酰胺鍵連接，在體內可降解，具有較好的生物相容性。此外，固相合成方便易行，他們不僅具有精確的結構，易于研究其構效關系，可為進一步結構優化提供信息，還能在特定位置引入特定的官能團，滿足基因載體需要克服的重重障礙。經過不斷地探索優化，目前該課題組已經合成了上千個多功能的化合物，通過改變空間結構和多種不同官能團的引入，系統性地考察了他們作為基因載體的應用，獲得了一系列安全有效的基因載體，并建立了初步的構效關系[32-36]，為基因遞送系統的研究提供了新思路。

4 結語

PEI作為核酸遞送領域中最經典的非病毒基因載體之一，一直是基因遞送領域的研究熱點，常被認為是DNA遞送載體的黃金標準。PEI可誘導細胞自噬和破壞質膜的穩定，這可能與其細胞毒性密切相關，一定程度上限制了其在基因遞送中的應用。針對PEI的化學結構修飾的主要利用PEI上的氨基與其他化合物的羧基形成酰胺鍵來實現。研究表明，采用多糖、小分子以及生物可降解片段對PEI進行結構修飾后，顯示出優良的生物相容性，同時，可增強基因轉染效率并降低毒性。此外，通過PEG和配體的修飾，除了減少PEI毒性，還賦予其靶向特定作用部位的能力。目前針對PEI的結構修飾仍處于基礎研究階段，目的在于提高轉染效率、降低毒性，在其臨床和產業化的應用上，還需要解決產率、穩定性、重現性和安全性等問題。基因遞送載體的開發充滿了機遇與挑戰，開發高效低毒的基因載體是實現基因治療的關鍵，也是基因載體領域的發展方向，基于PEI的非病毒基因遞送系統的研究，為基因載體的開發提供了依據，也為基因治療的研究奠定了基礎。