喜樹堿衍生物NCP4在不同種屬肝微粒體中代謝穩定性研究

劉瓊艷，張美琴,2，卿 晨*，李 霽*

1昆明醫科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，昆明 650500；2云南新興職業學院，昆明 650501

喜樹堿是從中國珙桐科植物中提取的一種生物堿，具有顯著的體內外抗腫瘤活性。機制研究發現，細胞DNA拓撲異構酶I (topoisomerase，Top1)是其主要的作用靶點。但在臨床試驗中發現，喜樹堿類化合物對腫瘤患者的療效與在嚙齒類動物模型的效果有很大差異，同時病人伴隨嚴重的毒副反應，如膀胱出血、骨髓抑制等，使其在臨床的應用受到很大限制[1]。究其原因是因為人體血液與嚙齒類動物血液的pH值存在較大差異，后者使得喜樹堿化學結構中E環的內酯結構保持在閉環，而此結構狀態是其抗腫瘤活性所必需。而人血液的pH值卻使喜樹堿結構中的內酯環(E環)打開，成為其在臨床應用中活性下降、毒性增加的主要原因。

因此，對喜樹堿結構進行改造優化一直是喜樹堿類抗腫瘤藥的研究熱點。目前臨床應用的喜樹堿類抗癌藥有拓撲替康[2,3]、伊立替康[4]和10-羥基喜樹堿[5]，此外尚有若干喜樹堿類衍生物處在臨床前研究和臨床研究的不同階段，如9-硝基喜樹堿(9-NC)已完成了胰腺癌的Ⅲ期臨床研究[6,8]，但也由于其嚴重的毒副反應而終止。

化合物 NCP4是在9-NC分子的20(S) 羥基位引入碳酸酯結構[9]，旨在降低其開環速度，以達到提高抗腫瘤活性、改善溶解度并降低毒性的目的。我們前期的體內外實驗研究表明，NCP4對腫瘤的生長具有顯著的抑制作用，毒性顯著低于9-NC。但對化合物NCP4的穩定性和代謝方面的研究尚未進行。

對候選化合物代謝的研究是藥物研發的重要內容。肝臟是藥物代謝的主要場所，擁有細胞色素P450等多種代謝酶。這些代謝酶主要存在于肝微粒體中，決定藥物代謝途徑、代謝速率，與藥物清除率直接相關[10，11]。采用體外肝微粒體溫孵系統進行代謝研究，不僅可排除體內諸多因素的干擾，還具有反應干擾小、操作簡單、代謝條件易于控制等優點。同時，體外代謝還能迅速有效地解決藥物代謝中的關鍵問題，例如代謝物結構鑒定、代謝途徑推斷等，為體內代謝研究提供重要的線索和依據[12]。

為此，本研究選擇人、SD大鼠、beagle犬的體外肝微粒體溫孵體系，建立HPLC-UV-MS(Q-TOF)定性分析方法，尋找化合物NCP4的代謝產物，探討NCP4體外代謝動力學特征，考察NCP4在不同種屬間代謝的差異,為NCP4相關藥理學、毒理學及藥動學的研究尋找合適的動物模型，提供科學依據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

3-18KS臺式低溫離心機；YCD-EL259冰箱(合肥美菱股份有限公司)；VCX150氮氣吹干儀(昆明鵬翼達氣體產品有限公司)；HPLC-UV-MS(Q-TOF)(安捷倫科技有限公司)

1.2 試劑

SD大鼠肝微粒體、beagle犬肝微粒體以及人肝微粒體蛋白濃度為20 mg/mL，購自瑞德肝臟疾病研究有限公司，磷酸緩沖液(PBS)購自Therno公司，NADPH系統購自Sigma公司，叔丁基甲基醚、甲醇(批號151130)、色譜純乙腈購自德國Merck公司，色譜純乙酸銨購自美國Tedia公司，色譜純甲酸購自德國Fluka公司，大鼠和人血漿由本實驗室自采。

2 方法

2.1 孵育混合液的組成

SD大鼠孵育混合液：100 mM的PBS(pH7.4)，SD大鼠肝微粒體蛋白(終濃度為0.5 mg/mL)，化合物NCP4(終濃度為5 μg/mL)。

beagle犬孵育混合液：100 mM的PBS(pH7.4)，Beagle犬肝微粒體蛋白(終濃度為0.5 mg/mL)，化合物NCP4(終濃度為5 μg/mL)。

人孵育混合液：100 mM的PBS(pH7.4)，人肝微粒體蛋白(終濃度為0.5 mg/mL)，化合物NCP4(終濃度為5 μg/mL)。

2.2 試驗方法

分別取180 μL的孵育液，在37 ℃恒溫水浴箱中預孵育5 min，然后加入20 μL NADPH(終濃度1 mM)啟動反應，孵育完畢后使用0.8 mL的冰乙腈終止反應。

選取0、2、5、10、15、30、60、90、120 min的孵育樣品作為不同種屬肝微粒體孵育反應的研究對象，按照各樣品的時間要求進行溫孵。

0 min是在180 μL孵育液中先加入0.8 mL冰乙腈終止反應后，再加入20 μL 的NADPH液。空白基質樣品是取不含藥的孵育液，加入20 μL 的NADPH液，再加入0.8 mL冰乙腈沉淀蛋白。終止反應后的樣品及空白基質加叔丁基甲基醚1 mL在7 155×g離心10 min，取上清液0.8 mL，氮氣吹干，采用100 μL 90%甲醇復溶，渦旋3 min后離心取上清液進行HPLC-UV(Q-TOF)分析。比較NCP4在SD大鼠、Beagle犬、人肝微粒體中的溫孵結果，分析其代謝產物。

2.3 色譜及質譜條件

色譜條件：Diamonsil C18(4.6×150 mm，5 μm)；流動相：水：甲醇(30∶70)等度洗脫；柱溫：25 ℃，流速：0.5 mL/min；紫外檢測波長370 nm；進樣量20 μL，分析時間23 min。

質譜條件：本實驗選擇ESI正離子模式、全掃描方式(m/z100～1 000)，霧化氣壓35 psi，干燥氣流速9 mL/min，離子化電壓為3 500 V，碎片電壓175 V。

2.4 數據分析計算公式及相關參數

實驗選用SD大鼠、beagle犬、人等三個種屬的肝微粒生物基質對NCP4進行體外溫孵，采用高效液相色譜法對NCP4的剩余量進行測定，并且計算相關的代謝動力學參數。

肝微粒體代謝穩定性相應的參數估算公式如下：

T1/2=0.693/k

(1)

CHint=0.693/T1/2×[Incubation(mL)/Microsomes(mg)]×[Microsomes(mg)/Liver(g)]×[Liver(g)/BW(kg)]

(2)

CLh=(Qh×CLint)/(Qh×CLint)

(3)

公式(2)和公式(3)中各參數均為經驗值，相關數值經參考文獻總結見表1。

表1 肝微粒體生化參數經驗值Table 1 The empirical values of liver microsomes biochemical parameters

3 結果

3.1 NCP4分別在不同種屬肝微粒體中的代謝穩定性及動力學參數

3.1.1 NCP4在SD大鼠肝微粒體樣品中的體外代謝穩定性

將NCP4在0 min時的峰面積作為100%，其他時間點與0 min時間點的峰面積相比得到NCP4的剩余百分比(area%)，結果見表2，可以看出NCP4在60 min內代謝完全。將各時間點NCP4的剩余百分比的自然對數與相應的孵育時間進行線性回歸，求得斜率(-k)，線性關系良好的ln(area%)與孵育時間計算結果見圖1。回歸方程：y=-0.132 9x+4.718 6，R2=0.994 8，說明NCP4在鼠肝微粒體孵育體系中0～30 min時間范圍內呈現線性消除。由公式(1)-(3)計算NCP4在SD大鼠肝微粒體中的半衰期Tl/2(min)、肝固有清除率CLint(mL/min/kg)和肝清除率CLh(mL/min/kg)分別為5.21 min、11.91 mL/min/kg和9.80 mL/min/kg。

3.1.2 NCP4在beagle犬肝微粒體樣品中的體外代謝穩定性

NCP4在0 min時的峰面積作為100%，其他時間點與0 min時間點的峰面積相比得到NCP4的剩余百分比(area%)，結果見表3，可以看出NCP4在90 min內代謝完全。將各時間點NCP4的剩余百分比的自然對數與相應的孵育時間進行線性回歸，求得斜率(-k)，線性關系良好的ln(area%)與孵育時間計算結果見圖2。回歸方程：y=-0.062 2x+4.474 9，R2=0.994 3，說明NCP4在狗肝微粒體孵育體系中0～60 min時間范圍內呈現線性消除。由公式(1)～(3)計算NCP4在狗肝微粒體中的半衰期Tl/2(min)、肝固有清除率CLint(mL/min/kg)和肝清除率CLh(mL/min/kg)分別為11.1 min、7.78 mL/min/kg和6.22 mL/min/kg。

表2 NCP4在鼠肝微粒體孵育體系中剩余百分比(area%)的結果Table 2 The remaining percentage of NCP4 in rat liver microsome incubation system (area%)

圖1 NCP4在SD大鼠微粒體孵育體系中ln(area%) 值與孵育時間的線性關系圖Fig.1 Linear relationship between ln(area%) and incubation time of NCP4 in SD rat microsome incubation system

3.1.3 NCP4在人肝微粒體樣品中的體外代謝穩定性

NCP4在0 min時的峰面積作為100%，其他時間點與0 min時間點的峰面積相比得到NCP4的剩余百分比(area%)，結果見表4，可以看出NCP4在120 min內代謝完全。將各時間點NCP4的剩余百分比的自然對數值與相應的孵育時間進行線性回歸，求得斜率(-k)，線性關系良好的ln(area%)值與孵育時間計算結果見圖3。回歸方程：y=-0.040 9x+4.470 5，R2=0.990 3，說明NCP4在人肝微粒體孵育體系中0～90 min時間范圍內呈現線性消除。由公式(1)～(3)計算NCP4在人肝微粒體中的半衰期Tl/2(min)、肝固有清除率CLint(mL/min/kg)和肝清除率CLh(mL/min/kg)分別為16.9 min、2.54 mL/min/kg和2.29 mL/min/kg。

表3 NCP4在beagle犬肝微粒體孵育體系中剩余百分比(area%)的結果Table 3 The remaining percentage (area%) of NCP4 in beagle canine liver microsome incubation system

圖2 NCP4在beagle犬肝微粒體孵育體系中ln(area%) 值與孵育時間的線性關系圖 Fig.2 Linear relationship between ln(area%) and incubation time of NCP4 in beagle dog liver microsome incubation system

表4 NCP4在人肝微粒體孵育體系中剩余百分比(area%)的結果Table 4 The remaining percentage (area%) of NCP4 in human liver microsome incubation system

圖3 NCP4在人肝微粒體孵育體系中ln(area%) 值與孵育時間的線性關系圖Fig.3 Linear relationship between ln(area%) and incubation time of NCP4 in human liver microsome incubation system

圖4 NCP4在不同種屬肝微粒體中孵育結果Fig.4 Incubation results of NCP4 in different species liver microsomes incubation system

3.2 NCP4在不同種屬肝微粒體孵育液中代謝產物結構鑒定

3.2.1 NCP4在SD大鼠肝微粒體溫孵樣品中代謝產物結構鑒定

NCP4在SD大鼠肝微粒體溫孵體系下溫孵60 min(圖5c)和120 min(圖5d)后，發現均有4個新增的主要色譜峰，見圖5，NCP4及各產物的m/z[M+Na]+和保留時間數據如表5所示。其中M1和M2的m/z[M+Na]+均為502，比NCP4少了14，推測M1和M2均是NCP4脫去一分子甲基，M1和M2是同分異構體。M3的m/z[M+Na]+比NCP4(m/z516)要少56，推測M3是NCP4末端-O-C-斷裂脫去C4H9。M4的分子離子比NCP4少172，推測M4的代謝過程較為復雜。推測各個化合物的代謝途徑如圖6(A、B)所示。

圖5 SD大鼠肝微粒體溫孵樣時間點LC-UV分析色譜圖Fig.5 Typical LC-UV chromatogram of incubation sample 注：空白基質(a)、0 min(b) 、60 min(c)、120 min(d)；M1,M2,M3,M4均為NCP4在SD大鼠肝微粒體中溫孵后的代謝產物 Note:blank matrix (a),0 min (b),60 min (c)，120 min (d);M1, M2,M3,M4 are metabolites of NCP4 in rat liver microsomes incubation systems

3.2.2 NCP4在beagle犬肝微粒體溫孵樣品中代謝產物結構推斷

NCP4在beagle犬肝微粒體溫孵體系下溫孵不同時間的樣品在確定HPLC-UV-MS(Q-TOF)分離鑒別條件下進行分析，其中與空白基質和0 min點溫孵樣品比較，代謝產物較明顯的是60 min(圖7c)和120 min(圖7d)溫孵樣品。NCP4及各產物的m/z[ M+Na]+和保留時間數據如表6所示。推測可能的代謝途徑如圖8(A、B、C)所示。

表5 NCP4在SD大鼠肝微粒體孵育60 min后的降解產物色譜保留時間和質譜數據Table 5 Retention time and mass spectrometry data of NCP4 degradation products in SD rat liver microsomes (incubation time:60 min)

圖6 NCP4在鼠肝微粒體中代謝途徑推測Fig.6 Metabolic pathways of NCP4 metabolic product in SD rat liver microsome 注：A.代謝產物M1,M2,M3代謝途徑；B.代謝產物M4代謝途徑。Note:A.metabolic pathway of M1,M2 and，M3;B.metabolic pathway of M4 metabolic pathway.

3.2.3 NCP4在人肝微粒體溫孵樣品中代謝產物鑒定

NCP4在人肝微粒體溫孵體系下溫孵不同時間的樣品在確定的HPLC-UV-MS(Q-TOF)分離鑒別條件下進行分析，其中與空白基質和0 min點溫孵樣品比較，代謝產物較明顯的是60 min(圖9c)和120 min(圖9d)溫孵樣品。NCP4及各產物的m/z[M+Na]+和保留時間數據如表7所示。我們發現NCP4在人和beagle犬肝微粒體中的代謝產物一致，推測代謝途徑也一致(見圖8)。

圖7 Beagle犬肝微粒體溫孵樣時間點的LC-UV圖Fig.7 Typical LC-UV chromatogram of incubation sample 注：空白基質(a)、0 min(b)、60 min(c)、120 min(d)；M5,M6,M7,M8均為NCP4在犬肝微粒體中溫孵后的代謝產物。Note:blank matrix (a),0 min (b),60 min (c),120 min (d);M1,M2,M3,M4 are metabolites of NCP4 in dog liver microsome incubation systems.

表6 NCP4在Beagle犬肝微粒體溫孵60 min后的降解產物色譜保留時間和質譜數據Table 6 Retention time and mass spectrometry data of NCP4 degradation products in Beagle dog liver microsome incubation systems (incubation time:60 min)

4 討論

實驗分別對NCP4在不同種屬(SD大鼠、Beagle犬、人)肝微粒體溫孵體系中的底物代謝穩定性進行了研究，不同種屬肝微粒體孵育體系中NCP4的剩余量百分比與孵育時間的相關圖見圖4，可見體外代謝穩定性動態變化趨勢基本一致，其中Beagle犬與人肝微粒體溫孵體系中的底物代謝穩定性更為接近。

根據NCP4的剩余量與孵育時間以及肝微粒體生化參數經驗值，計算SD大鼠、Beagle犬和人肝微粒體溫孵代謝動力學參數Tl/2(min)、CLint(mL/min/kg)和CLh(mL/min/kg)，結果表明：NCP4在SD大鼠、Beagle犬和人三種不同種屬肝微粒體中代謝半衰期Tl/2(min) 、CLint(mL/min/kg )和CLh(mL/min/kg)范圍分別為5.21±277.2 min、2.54±11.91 mL/min/kg、2.29±9.80 mL/min/kg，其中Beagle犬和人肝微粒體溫孵代謝動力學參數Tl/2(min)相當，說明Beagle犬與人肝微粒體溫孵體系中NCP4底物的代謝穩定性基本一致。

圖8 NCP4在beagle犬及人肝微粒體中代謝途徑推測Fig.8 Metabolic pathways of NCP4 metabolic product in beagle dogs and human liver microsome 注：A.代謝產物M6,M7代謝途徑；B.代謝產物M5代謝途徑；C.代謝產物M8代謝途徑。Note:A.metabolic pathway of M6,M7;B.metabolic pathway of M5 metabolic pathway;C.metabolic pathway of M8.

圖9 人肝微粒體溫孵樣時間點的LC-UV圖Fig.9 Typical LC-UV chromatogram of incubation sample 注：空白基質(a)、0 min(b)、60 min(c)、120 min(d)；M5,M6,M7,M8均為NCP4在人肝微粒體中溫孵后的代謝產物。Note:blank matrix (a),0 min (b),60 min (c),120 min (d);M1,M2,M3,M4 are metabolites of NCP4 in human liver microsome incubation systems.

表7 NCP4在人肝微粒體溫孵60 min后的降解產物色譜保留時間和質譜數據Table 7 Retention time and mass spectrometry data of NCP4 degradation products in human liver microsome incubation systems (incubation time:60 min)

同時，本實驗還分別對NCP4在不同種屬(SD大鼠、beagle犬、人)肝微粒體溫孵體系中的代謝產物進行了研究，結果表明NCP4在SD大鼠肝微粒體中生成m/z[M+Na]+為502、460、344的代謝產物，在Beagle犬、人肝微粒體中生成m/z[M+Na]+為388、390、448的代謝產物。表明NCP4在犬及人肝微粒體中代謝產物相同。

綜上所述，我們可以選擇beagle犬作為NCP4臨床前研究的動物模型，用于NCP4的臨床前藥理學、毒理學及藥代動力學等相關研究。