口腔鱗癌中結合珠蛋白與腫瘤血管生成的初步研究

魏亞茹 吳健 段曉峰 高瓊 瞿澤豐

口腔鱗癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）占口腔惡性腫瘤的80%［1］。OSCC與慢性刺激因素（如煙草，吸煙，酒精和嚼檳榔）有關［2］。其致死原因主要是局部復發及全身轉移。據WHO統計，每年全世界新增口腔頜面部惡性腫瘤患者中，發展中國家超過32萬人，死亡近9萬人［3-4］。我國人口基數大，據統計每年新發病例約4.56萬人，且近年發病率呈上升趨勢。所以口腔頜面部惡性腫瘤的防治不容忽視［3，5］。雖然目前手術切除是治療OSCC最好的辦法，但是根治性切除，術后5年的復發率仍較高，生存率＜50%，精準治療是未來推崇的趨勢，通過基因組或蛋白質組學高通量技術發現的新生物標志物或生物標志物模式能夠對某些人類疾病，特別是惡性腫瘤進行更可靠的早期診斷。本課題組前期研究發現［6］，結合珠蛋白（haptoglobin，Hp）在口腔鱗癌血清中的表達高于健康人的血清，這表明觸珠蛋白可能成為口腔鱗癌的血清腫瘤標記物之一。目前，腫瘤血管生成的及抗血管生成的研究是治療腫瘤的一個新方向。因此，本文旨在研究結合珠蛋白在口腔鱗癌和健康人組織中的表達差異，并探討結合珠蛋白在口腔鱗癌中與血管生成的關系。

本研究采用Western blot技術，比較Hp在口腔鱗狀細胞癌和健康人組織中的表達差異，再應用免疫組織化學染色的方法標記血管內皮細胞，觀察Hp在血管周圍的分布情況，用Weidner校正法計數微血管密度（microvessel density，MVD）。分析在口腔鱗狀細胞癌中，結合珠蛋白與血管生成的關系，為臨床應用抗血管生成來治療腫瘤提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究標本 標本來源于貴州醫科大學附屬醫院口腔頜面外科手術，未采用針對腫瘤的治療如手術、放療、化療等，且經病理證實的口腔鱗癌組織標本30例，對照口腔黏膜組織標本30例?？谇击[癌組織標本來源情況：男性23例，女性7例，年齡45～75歲，平均年齡60.2歲；其中高分化鱗癌21例，中分化鱗癌9例；對照口腔黏膜組織標本來源于拔牙病人，體檢健康，既往無腫瘤史。

1.1.2 主要試劑 兔抗人Hp單克隆抗體（ab13123-6，1∶6 000，Abcam公司，英國）、內參鼠抗人GAPDH單抗（HRP-60004，1∶2 000，三鷹公司）、HRP標記的羊抗兔二抗（GTX213110-01，1∶5 000，Gene Tex公司，美國）、0.22μm PVDF膜、一抗稀釋液、二抗稀釋液、BSA封閉液、BCA蛋白定量試劑盒［PierceTMBCA Protein Assay Kit（Prod＃23227），賽默飛，美國］；SDS-PAGE凝制膠試劑盒［P0012A，北京索萊寶（Lot.No.2016042-1）］；ECL-Plus發光試劑（Millipore Immobilon Western公司，美國）等；兔抗人Hp單克隆抗體（1∶100，Gene Tex公司，美國）；鼠抗人CD31單克隆抗體（1∶200）、山羊血清封閉液（ZLI-9022）、內源性過氧化物酶阻斷劑（BF06097）、Polymer雙染檢測試劑盒（DS-0001）（中杉金橋公司）等。

1.1.3 主要實驗儀器 -80℃冰箱（TSX2305GA，賽默飛，美國）；酶標儀（ELx800，Bio-Tek，美國）。顯微鏡（TE2000-U，Nikon公司，日本）；超凈工作臺（SWCJ-1F，濟南博涵生物科技有限公司）、石蠟切片機（RM2235，Lecia，德國），Exceed-AC-08型超純水儀（Exceed-AC-08，成都艾科有限公司）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 Western blot免疫印跡法 所有標本-80℃保存待用。提取蛋白時，于冰上切取大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm組織置于1.5 mlEP管中，加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑，置于冰塊上進行手動研磨直組織徹底溶解，于高速離心機中以12 000 r／min，4℃高速離心15 min后，取上清液，棄沉淀物。BCA法測定總蛋白濃度、變性蛋白；制膠、電泳；轉膜，結束后TBST洗3次，5 min／次；室溫封閉1.5 h；一抗兔抗人Hp單抗4℃冰箱過夜孵育；TBST洗3次，8 min／次，結束后羊抗兔二抗室溫孵育1 h；TBST洗3次，8min／次，結束后加入ECL發光液顯色，化學發光儀曝光顯色，用Image-Pro Plus進行圖像數據分析。

1.2.2 免疫組織化學染色法 所有OSCC組織及口腔正常組織首先均經中性甲醛固定，然后進行石蠟包埋和連續切片（5μm）。60℃烤片1 h；脫蠟、水化；滅活內源性過氧化物酶和堿性磷酸酶活性15 min；檸檬酸鹽緩沖液抗原修復20 min，室溫冷卻，PBST洗3次，5 min／次；山羊血清室溫封閉1 h；滴加配制好的一抗（鼠抗人CD31單抗1∶100、兔抗人Hp單抗1∶100，二者混勻），4℃過夜；室溫復溫30 min，PBST洗3次，5 min／次；滴加配置好的二抗（辣根酶標記羊抗鼠IgG聚合物、堿磷酶標記羊抗兔IgG聚合物，二者混勻），室溫孵育30 min，PBST洗3次，2 min／次；DAB顯色液顯色，PBST洗3次，2 min／次；GBI-久紅溶液顯色，蒸餾水沖洗終止顯色；封片。每張切片皆經過半定量計分系統進行評估。先將染色陽性的病理切片置于100倍的鏡下觀察抗原的表達情況，然后換成400倍的鏡下隨機選取10個視野，按陽性細胞所占比例進行分級，由2位病理科醫生進行盲評。

1.3 統計學處理

采用SPSS 22.0軟件對以上數據行χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義，P＜0.01差異有顯著統計學意義。

2 結 果

2.1 Western blot免疫印跡法結果

Western blot檢測30例OSCC及30例對照口腔黏膜組織表達情況見圖1。

圖1 Western blot檢測Hp在口腔鱗癌及對照組組織中的表達Fig 1 Hp expression in OSCC and control tissues examined by Western blot

2.2 免疫組織化學染色結果

Hp主要位于OSCC細胞間質中，呈紅色；CD31定位于血管內皮細胞細胞膜，呈棕黃色。在OSCC中可見大量的微血管存在，血管呈條索狀、點狀、出芽狀及血管內皮細胞呈族狀聚集；對照組織中微血管明顯減少。Hp均圍繞著血管分布，在OSCC中高表達，染色深；對照組織中低表達，染色淺（圖2）。OSCC組織中Hp的表達明顯高于對照組織（P＜0.01）（表1）。

Hp表達與OSCC臨床病理學參數的關系見表2。不同組織學分級的口腔鱗癌間質中，其Hp的表達率有明顯的差異，分化程度越低者，Hp表達率越高，差異有統計學意義（P＜0.05）；Ⅲ～Ⅳ期中Hp的表達較Ⅰ～Ⅱ期明顯升高，差異有統計學意義，P＜0.05；但Hp的表達與患者年齡、性別、無顯著關系（P＞0.05）。

圖2 Hp在對照口腔組織及口腔鱗癌組織中的表達（免疫組化，×400）Fig 2 Hp expression in control oral tissue and OSCC（IHC，×400）

表1 口腔鱗癌組織及對照組織中Hp的表達 （n＝30）Tab 1 Hp expression in OSCCand control tissues（n＝30）

OSCC中Hp的表達與微血管密度（MVD）的關系見表3。OSCC中Hp陽性表達的MVD高于Hp陰性者（P＜0.05）。

表3 OSCC中Hp的表達與MVD的關系Tab 3 The relationship between Hp expression and MVD in OSCC

3 討 論

口腔鱗狀細胞癌是一類嚴重危害人類健康的惡性腫瘤，占口腔惡性腫瘤的80%，在頭頸鱗癌（HNSCC）中也占較大比例，死亡率極高。傳統的手術、放療、化療因其各自的局限性而不能達到滿意的療效。雖然目前手術切除是治療OSCC最好的辦法，但是根治性切除，術后5年的復發率仍較高，生存率＜50%［7］。因而研究新的抗腫瘤治療的靶點就顯得尤為重要。

Hp由Polonovski和Jayle首次發現，是一種分子量為85 000的急性期反應蛋白［8］。Hp又叫觸珠蛋白，是血清α2球蛋白組分中的一種酸性糖蛋白，廣泛存在于人類和許多哺乳動物的血清及其他體液中。主要功能是通過與血清中游離的血紅蛋白結合，形成穩定的結合珠蛋白-血紅蛋白復合物，將血紅蛋白轉運至肝臟中代謝，從而避免血紅蛋白和鐵從腎臟丟失及其對腎臟的損傷。此外，還參與宿主抗感染、損傷組織的修復及內環境的穩定，其血清含量在感染、創傷、炎癥、腫瘤、心肌梗死等病理狀態時顯著升高。除以上的功能外，Hp還具有抗氧化、抗菌、抑制前列腺素合成及NO功能、促進血管生成及調節免疫等功能［9］。對肺癌［10］、胰腺癌［11］、肝癌［12］患者血清與正常人血清差異蛋白的研究提示Hp在病理血清中表達上調。蛋白質組學識別Hp作為口腔鱗狀細胞癌中的新型血漿生物標志物的研究中發現觸珠蛋白水平升高與OSCC臨床分期呈強相關（Pb 0.01），表明Hp作為敏感血漿生物標志物具有很大的潛力，可用于早期檢測OSCC患者［13］。Hp表達與HNSCC患者復發率的關系研究中發現倆者密切相關，而且多變量分析證實復發風險升高，因此Hp的細胞表達可能是HNSCC中的預后因子［14］。

1979年，Folkman等［15］提出“腫瘤血管生成（angiogenesis，AG）的概念”，發現腫瘤生長分為2個階段：無血管期和血管期。在無血管期，腫瘤直徑處于1～2 mm，此時腫瘤生長依賴于周圍原有血管系統通過彌散獲得氧和營養物質，這嚴重的限制了腫瘤細胞的生長及其向遠處擴散的可能性；當腫瘤直徑大于1～2 mm時，需要誘導生成新的血管來獲取血供，否則腫瘤就會因缺血缺氧發生壞死。實體腫瘤的生長及存活依賴血管形成，新生血管通過灌注形式為腫瘤細胞生長提供營養，也是腫瘤細胞代謝產物排泄的有效途徑，同時也是腫瘤向遠處轉移的重要途徑。大量研究表明，腫瘤血管生成與腫瘤浸潤、轉移、及復發密切相關。

本課題組前期通過蛋白質組學的方法建立人OSCC組織與正常口腔組織中的差異蛋白表達，進行質譜鑒定發現Hp在口腔鱗癌外周血清中的表達高于健康人的血清，這表明觸珠蛋白可能成為口腔鱗癌的血清腫瘤標記物之一。

實驗采用Western blot技術，比較Hp在OSCC和健康人組織中的表達差異，再應用免疫組織化學染色的方法標記血管內皮細胞，觀察Hp在血管周圍的分布情況，用Weidner校正法計數微血管密度（MVD）［15］。結果提示Hp在OSCC組織中表達顯著升高；OSCC中的MVD明顯高于正常組織；在OSCC和對照組織中，Hp均圍繞著血管分布，且Hp在OSCC中的表達明顯較對照組織升高。這表明在OSCC中，Hp的表達可能和MVD呈正相關，Hp對腫瘤的血管生成可能有促進作用。有關它在OSCC中的具體作用，本課題組將在以后的研究中繼續探索。目前，腫瘤血管生成的及抗血管生成的研究是治療腫瘤的一個方向［16］，相信Hp不僅能為OSCC的早期診斷及預后評估提供依據，還能為OSCC的臨床治療提供新的靶點。