飲料及配制酒中11種有機合成色素的低共熔溶劑萃取/高效液相色譜法測定

周 佳，禹 潔，朱書強，邵永華,黃 韡，祖 新

(甘肅省食品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730030)

我國允許添加的有機合成色素包括新紅、檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅、酸性紅、亮藍、靛藍、赤蘚紅、喹啉黃等11種。其中，喹啉黃為2-(2-喹啉基)-茚滿基-1,3-二酮單磺酸鈉鹽和2-(2-喹啉基)-茚滿基-1,3-二酮二磺酸二鈉鹽的混合物，一鈉鹽和二鈉鹽各存在2個同分異構體[1]，所以喹啉黃的含量按照4種混合物的加和值進行計算。

有機合成色素大多由萘酚、對氨基苯磺酸化合而成，在人體內可代謝產生強致癌性物質，尤其是偶氮類合成色素，進入人體后在偶氮還原酶的作用下會生成芳香胺類化合物，并與靶細胞作用引起癌癥[2-3]。研究表明，長期攝入含有機合成色素的食品會引起過敏癥(哮喘、鼻炎等)，導致兒童出現脾氣暴躁、注意力下降、多動癥等癥狀，甚至會影響其智力[4]。GB 2760-2014標準中規定了相關添加劑的使用范圍及限量[5]。但受利益的驅使，超范圍、超標使用有機合成色素的情況時有發生。綜上，為了老百姓舌尖上的安全，檢測有機合成色素是非常有必要的。目前檢測有機合成色素的方法有高效液相色譜法[1,6-7]、液相色譜-串聯質譜法[1，8-9]、分光光度法[10]和薄層色譜法[11]等。但上述方法存在前處理步驟繁瑣、耗時長、試劑用量大、目標物損失大等缺點。

綠色溶劑作為一種環境友好的新型萃取溶劑，近年來日益受到關注。其中，低共熔溶劑(DES)是由氫鍵受體(季銨鹽)與氫鍵供體(醇、酸等)通過氫鍵作用形成的液體混合物[12-14]。按照溶解性的不同，DES可分為親水性和疏水性。由于其具有生物降解性、不可燃性、價廉、易制備、環境友好等特點[15]，受到了廣泛應用[16]。例如，以氯化膽堿和乙二醇合成的DES萃取調味油中的酸性橙Ⅱ、堿性橙21和堿性橙22[17]；以氯化膽堿和乳酸合成的DES萃取香茶藨子葉片中總酚酸、總黃酮[18]；以氯化膽堿和甘油合成的DES萃取食用油中鉛和鎘[19-20]等。然而，上述研究多采用親水性DES進行目標物萃取，并不適用于水基樣品。

本研究以四丁基氯化銨和辛酸為原料合成疏水性DES，并將其作為萃取溶劑，建立了飲料、配制酒中新紅、檸檬黃等11種有機合成色素的高效液相色譜-二極管陣列檢測(HPLC-DAD)分析方法。與傳統方法相比，本方法操作步驟更簡單、檢測損失更少、目標物種類更多。

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

四辛基氯化銨、四甲基氯化銨、四丁基氯化銨、1-乙基-3-甲基咪唑氯鹽、1-己基-3-甲基咪唑氯鹽(上海成捷化學有限公司)。標準品：檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、酸性紅、亮藍、靛藍、赤蘚紅、新紅、喹啉黃(純度>98%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)，甲醇(色譜純，美國Fisher公司)，癸酸、辛酸、水楊酸(分析純，上海安譜實驗科技股份有限公司)。去離子水由GenPure UV-TOC/UF×CAD plus超純水機(美國賽默飛世爾科技公司)制備。

液體樣品均購于當地超市。碳酸飲料、茶飲料、配制酒樣品直接使用，果蔬汁飲料、蛋白飲料樣品稀釋10倍，離心后取上清液作為樣品待測液。

1.2 儀器與設備

Waters 2695高效液相色譜儀(美國沃特世公司，配DAD檢測器)；控溫磁力攪拌器、Genius 3渦旋儀(德國IKA公司)；玻璃注射器(10 mL,上海安譜實驗科技股份有限公司)；液相微量進樣針(10 μL,日本島津公司)。

1.3 溶液的配制

分別稱取適量11種目標物的標準物質，以去離子水溶解配制成單一標準儲備液(1 000 μg/mL)，并于4 ℃儲存備用。

分別吸取各單一標準儲備液，以去離子水溶解配制成混合標準溶液，其中檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅、酸性紅、靛藍、赤蘚紅、新紅、喹啉黃3(QYNa Ⅰ)、喹啉黃4(QYNa Ⅱ)的質量濃度為1.0 μg/mL，喹啉黃1(QYNa2Ⅰ)、亮藍為2.0 μg/mL，喹啉黃2(QYNa2Ⅱ)為4.0 μg/mL。

1.4 實驗方法

1.4.1 低共熔溶劑的制備按照表1制備低共熔溶劑，分別稱取氫鍵供體和氫鍵受體于25 mL圓底燒瓶中，在40 ℃油浴中加熱至兩種混合物變成透明澄清液體，自然冷卻至室溫后備用。

表1 低共熔溶劑的合成條件Table 1 Synthesis conditions of deep eutectic solvents

(續表1)

No.Hydrogen bond acceptorHydrogen bond donorMole ratioDES-6Tetraoctyl ammonium bromide(四辛基溴化銨)Octanoic acid(辛酸)DES-71-Ethyl-3-methylimidazolium chloride(1-乙基-3-甲基咪唑氯鹽)Octanoic acid(辛酸)DES-81-Ethyl-3-methylimidazolium chloride(1-乙基-3-甲基咪唑氯鹽)Decanoic acid(癸酸)DES-91-Ethyl-3-methylimidazolium chloride(1-乙基-3-甲基咪唑氯鹽)Salicylic acid(水楊酸)DES-101-Hexyl-3-methylimidazolium chloride(1-己基-3-甲基咪唑氯鹽)Octanoic acid(辛酸)DES-111-Hexyl-3-methylimidazolium chloride(1-己基-3-甲基咪唑氯鹽)Decanoic acid(癸酸)DES-121-Hexyl-3-methylimidazolium chloride(1-己基-3-甲基咪唑氯鹽)Salicylic acid(水楊酸)

1.4.2 目標物的萃取將200 μL疏水性DES置于10 mL玻璃注射器中,準確吸取5 mL混合標準溶液(或樣品待測液)注入上述玻璃注射器，渦旋2 min。靜置3 min,將油狀液滴推至注射器口，用微量進樣針吸取疏水性DES于2 mL壓蓋離心管，以甲醇溶解并定容至0.5 mL,過0.45 μm微孔有機濾膜后，待測。

1.4.3 色譜條件色譜柱：CAPCELL PAK MGⅡ C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm,日本資生堂)；柱溫：35 ℃；進樣體積：10 μL；檢測波長：254 nm;流動相：A為0.02 mol/L乙酸銨水溶液，B為甲醇，流速為0.8 mL/min。梯度洗脫程序：0.01～7.00 min，20%～35%B；7.00～9.00 min，35%～80%B；9.00～19.00 min，80%～95%B；在0.01 min內線性遞減至20%B，保持6 min。

2 結果與討論

2.1 特異性低共熔溶劑的選擇

采用表1中合成的12種DES對11種目標物進行特異性吸附試驗，結果顯示，DES-6無吸附效果；DES-4、DES-7與目標物發生反應，進而使溶液顏色消退；DES-8、DES-9、DES-11對目標物有輕微的吸附效果，但DES析出并上浮；DES-3、DES-12對目標物有輕微的吸附效果，但DES析出并沉淀；DES-1、DES-2、DES-5、DES-10對目標物有明顯吸附，且呈油狀液體懸浮于樣品中。

進一步對比了DES-1、DES-2、DES-5、DES-10的萃取效率，結果表明DES-1的萃取效率最佳且易于吸取，DES-2的萃取效率次之但不易吸取。DES-1的液體黏度及表面張力相對最低，有助于提高DES液滴在水中的分散性，從而提高目標物的萃取率。這是因為DES烷基鏈長度的增加會導致黏度增大，不利于其在水中分散；同時由于目標物均為水溶性，按照相似相溶理論，DES碳鏈越長，則極性越弱越難萃取目標物，因此萃取效率會下降。綜上，最終選用經四丁基氯化銨和辛酸合成的DES-1作為特異性低共熔溶劑。

2.2 萃取容器的選擇

圖1 低共熔溶劑用量對11種目標物萃取效率的影響Fig.1 Effect of deep eutectic solvent amount on the extraction efficiencies of 11 analytesa：lemon yellow；b：new red；c：amaranth；d：indigo；e：carmine；f：QYNa2 I；g：sunset yellow；h：QYNa2 Ⅱ；i:allura red；j：brilliant blue；k：acid red；l:QYNa I；m:QYNa Ⅱ；n：erythrosine

由于DES多為油狀液滴，易粘附在容器壁上，因此本實驗對萃取容器進行了考察。結果顯示，以塑料注射器為萃取容器時，DES附著于器壁上，不利于目標物的測定。而以玻璃注射器為萃取容器時，DES吸附目標物并凝結為油狀液滴浮于上層，易于分離測試。故選用玻璃注射器作為萃取容器。

2.3 低共熔溶劑用量的選擇

參照GB 2760-2014[5]對有機合成色素的限量要求，并根據實際樣品中有機合成色素的含量，考察了DES用量對11種目標物萃取效率的影響。由圖1可知，當DES的用量為50 μL時，檸檬黃的萃取率達98%；當增加DES的用量至150 μL時，新紅、胭脂紅、日落黃、亮藍、酸性紅、喹啉黃3、赤蘚紅的萃取率均達92%以上;增加DES用量至200 μL時，莧菜紅、靛藍、喹啉黃1、喹啉黃2、誘惑紅、喹啉黃4 的萃取率均達97%;繼續增加DES用量時，11種目標物的萃取率無明顯增大。綜上，當DES的用量為200 μL時，11種有機合成色素(14種待測物質)的萃取率均達97%以上，故選擇DES的最佳用量為200 μL。

2.4 待測液pH值的影響

考慮到實際樣品的pH值不同，如碳酸飲料、果蔬汁飲料、葡萄酒、茶飲料、蛋白飲料等的pH值偏酸性，飲用水的pH值偏中性，因此對待測液的pH值(pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)進行了考察。采用200 μL DES分別萃取3 min后進行測定，結果顯示pH值對萃取效果的影響不大，因此不調節待測液的pH值。

2.5 渦旋時間的影響

采用200 μL DES對“1.3”中的混合標準溶液進行萃取并上機測試，考察不同渦旋時間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 min)對目標物萃取效率的影響。萃取率的計算如下：X=(Ai/Astdi)×100% (X為萃取率；Ai為對混合標準溶液萃取后目標物的峰面積；Astdi為混合標準溶液中目標物的峰面積)。結果表明，檸檬黃、莧菜紅在渦旋時間為2 min時萃取率>98%，其余目標物在渦旋時間為3 min時萃取率>98%，綜合考慮最終選擇最優渦旋時間為3 min。

2.6 液相色譜條件的優化

采用GB 5009.35-2016[6]及文獻[1]中的液相色譜條件對“1.3”中的混合標準溶液進行檢測，11種目標物無法完全出峰，存在峰重合、峰前沿的情況。由于目標物種類多，喹啉黃還需出4個色譜峰，故將流動相流速調整為0.8 mL/min，以保證充足的色譜出峰時間。考慮到流動相梯度對目標物峰形、靈敏度的影響，對流動相梯度進行了優化，具體梯度見表2。結果顯示，采用流動相梯度a時，混合標準溶液僅出10個色譜峰；采用梯度b 時出12個色譜峰；采用梯度c、d、e時，均出了13個色譜峰；當改用梯度f時，14種物質均得到有效分離，且峰形尖銳，能夠滿足定性定量的要求。因此，本實驗選擇流動相梯度f。

表2 不同流動相梯度Table 2 Gradient of different mobile phases

2.7 方法學驗證

2.7.1 線性關系與定量下限用0.02 mol/L乙酸銨水溶液-甲醇(80∶20)將各單一標準儲備液進行稀釋，其中喹啉黃1、亮藍的質量濃度分別為2.0、5.0、10、20、50、100 mg/L，喹啉黃2的質量濃度分別為4.0、10、20、50、100、160 mg/L，其余物質的質量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10、20、40 mg/L，按照本方法進行測定，以峰面積對質量濃度繪制標準曲線。結果表明：11種有機合成色素均線性關系良好，相關系數均大于0.996(見表3)。

向空白樣品中添加混合標準溶液，在最佳條件下進行測定，根據3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限(LOD)，10倍信噪比(S/N=10)計算定量下限(LOQ)，測得11種有機合成色素的檢出限為0.03～0.31 mg/kg，定量下限為0.08～1.02 mg/kg(見表3)。

2.7.2 回收率與相對標準偏差采用碳酸飲料進行加標實驗，向空白碳酸飲料樣品中添加3個水平的14種目標物質的單一標準儲備液，其中喹啉黃1和亮藍的加標水平為0.50、5.00、10.0 mg/kg，喹啉黃2為1.00、10.0、20.0 mg/kg，其余目標物質的加標水平均為0.25、2.50、5.00 mg/kg。按照“1.4”進行測定，每個水平平行測定3次。由表3可知，11種有機合成色素的回收率為92.6%～103%，相對標準偏差(RSD)為0.98%～4.3%，能滿足分析要求。

表3 11種有機合成色素的線性關系、檢出限、定量下限、回收率及相對標準偏差Table 3 Linear relations,LODs,LOQs,recoveries and relative standard deviations of 11 organic synthetic pigments

2.8 實際樣品檢測

采用本方法對購自蘭州市超市的碳酸飲料(5份)、茶飲料(5份)、果蔬汁飲料(10份)、蛋白飲料(5份)、配制酒(5份)進行測定，每個樣品平行測定5份。結果表明，有2份碳酸飲料、1份果蔬汁飲料、2份蛋白飲料、2份配制酒檢出有機合成色素，茶飲料未檢出。按照陽性樣品中有機合成色素的種類及含量添加相應的單一標準儲備液，進行加標回收實驗，回收率為92.4%～103%(見表4)。

表4 實際樣品的含量及加標回收率Table 4 Contents and recoveries of actual samples

圖2分別為陽性樣品(碳酸飲料2#)與11種有機合成色素標準品的色譜圖，其中喹啉黃=喹啉黃1+喹啉黃2+喹啉黃3+喹啉黃4。

2.9 與傳統方法的對比

將本文方法與GB 5009.35-2016[6]方法進行比較，結果顯示，本方法具有耗時短、試劑友好、成本低、可檢測的目標物數量多等特點(見表5)。

表5 本文方法與傳統方法的對比Table 5 Comparison between the method in this paper and the traditional method

3 結 論

本文以四丁基氯化銨和辛酸為原料合成了新型的疏水性低共熔溶劑，將其作為萃取溶劑，建立了快速、高效、同時檢測飲料、配制酒樣品中11種有機合成色素的HPLC-DAD法。結果表明，11種有機合成色素的檢出限為0.03～0.31 mg/kg，定量下限為0.08～1.02 mg/kg，回收率為92.6%～103%，相對標準偏差為0.98%～4.3%。本方法操作簡單、回收率高、快速高效、目標物多,可以廣泛應用于飲料、配制酒中有機合成色素的檢測。