一株堿性果膠酶產生菌的分離與培養條件研究

楊金宏，孔衛青

(安康學院 陜西省蠶桑重點實驗室，陜西 安康 725000)

家蠶(Bombyxmori)是一種重要的吐絲結繭的經濟昆蟲，桑葉是家蠶唯一的食物，家蠶對桑葉的消化吸收效率，暨葉絲轉化率(繭層量/食下量)是蠶桑生產效益的重要指標之一。腸道菌群定殖在宿主腸道內，與宿主相互依賴、互利共生，對宿主的消化吸收和生長發育有重要影響。家蠶腸道菌群豐富，高繪菊等對家蠶中腸菌群進行分離培養，顯示其中存在多種可以分泌蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、淀粉酶的菌種[1]。鄒昌瑞等分離培養柞蠶中腸菌，顯示芽孢桿菌是其主要菌群，可以產纖維素酶和蛋白酶[2]。但上述研究均未發現其中分泌果膠酶的菌株。

蠶沙是家蠶排泄物，含大量未被家蠶消化吸收的桑葉成分，其中果膠占風干蠶沙的10%～12%，是家蠶不能吸收利用的桑葉成分之一。外源添食纖維素單胞菌、枯草芽孢桿菌或外源性芽孢桿菌等，給家蠶添食均對家蠶的生長發育、腸道優勢菌群和經濟性狀有一定影響[3-6]。因此，研究家蠶產果膠酶菌株，通過外源添加菌群，促進家蠶對桑葉果膠的消化吸收，對提高家蠶葉絲轉化率具有重要意義。

中腸是家蠶分泌消化酶、消化吸收桑葉的主要場所，中腸腸液pH值在9.2以上，中腸中部的pH值甚至達10.5～11.0，強堿性環境抑制了果膠酶產生菌的發生。而中腸后部至排出蠶沙中的菌群研究鮮見報道。本研究擬分離家蠶蠶沙的果膠酶產生菌，為通過外源添加降解桑葉中果膠、提高家蠶對桑葉果膠成分的消化吸收和家蠶葉絲轉化率提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗使用的5齡3 d家蠶871×872飼養于安康學院恒口蠶桑科研基地，取樣前1 h置于超凈工作臺，用無菌樣品盒飼養，取排出30 min內的新鮮蠶沙。

1.2 菌株的分離篩選與鑒定

取1.1新鮮蠶沙3 g，加入到50 mL 富集培養液中，無菌玻璃棒攪拌，30℃ 160 r·min-1振蕩培養2 d后，按10-6～10-9梯度對培養液進行稀釋，并均勻涂布到分離培養基平板上，30 ℃培養2 d。后從平板上挑取較大的菌落，進行再次分離純化，獲得單菌落。在菌落周圍加入幾滴1%的CTAB，靜置10 min, 若有透明圈產生則為堿性果膠酶產生菌。

1.3 菌株16S rDNA序列獲取及分析

提取菌株的基因組DNA，16S rDNA通用引物對27F和1492R擴增菌株的16S rDNA，PCR擴增條件參照Oliwa-Stasiak等[7]。PCR擴增產物委托上海生工(生物工程)有限公司進行測序。測序結果進行在線BLASTN比對，同時下載克雷伯氏菌屬內物種的同源系列，MEGA 6.0軟件的極大似然法(Maximum Likelihood)構建系統進化樹，重復1 000次進行Bootstrap檢驗，確定菌株歸屬[8]。

1.4 培養條件的優化與生長曲線的測定

分別以淀粉、果膠、蔗糖、葡萄糖為碳源，配制濃度0.1 g·L-1，以硫酸銨、酵母粉、蛋白胨、蠶蛹粉為培養氮源，配制濃度0.05 g·L-1，正交設計配制菌株培養基100 mL，調節培養基初始pH值為8.0。1：100加入培養液，35℃培養2 d，3個重復篩選菌株生長最佳碳氮源。分別調節培養基初始pH為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，設定培養溫度為25 ℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50 ℃，研究培養基pH值和培養溫度對菌株生長的影響。采用測定培養液OD600或細菌計數法(THAOMA)分析培養結果。最后利用最優培養條件測定每隔5 h菌液的OD600，重復3次求平均值，繪制菌株生長曲線。

1.5 菌株產酶活性的測定

取培養2 d的菌液，無菌四層紗布過濾，濾液5 000 r·min-1離心15 min，上清液即為粗酶液。取粗酶液20 μL，與含0.2%聚半乳糖醛酸的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH8.6)2 mL混合，后分別添加5 mmol·L-1鈣、鎂、錳、鋅等二價離子至不同測試管，以未添加金屬離子測試管為對照，檢測不同金屬離子對酶活性的影響。30℃反應10 min，加入0.03 mol·L-1磷酸溶液3 mL終止反應，測定235 nm 處吸光度，記為A，以同樣體系加熱煮沸10 min的粗酶液做空白對照，每個樣品3個重復。

一個標準酶活單位(U)定義為：1 mL酶液每min使聚半乳糖醛酸裂解產生1 μmol的不飽和聚半乳糖醛酸的酶量。不飽和聚半乳糖醛酸在235 nm 處的摩爾吸光系數a為4 600 L·mol-1cm-1。根據公式：A=abc，其中b=1 cm，計算樣品濃度平均值c，計算標準酶活性。

2 結果與分析

2.1 菌株形態特征與CTAB顯色法鑒定

菌株在分離培養基30 ℃培養2 d的菌落為圓形(圖1A)，直徑1.5～2 mm，扁平，邊緣整齊，灰白色，稍微不透明，有淡淡的異味。利用CTAB顯色法對菌株進行鑒定，產生明顯的透明圈(圖1B)，初步確定該菌為堿性果膠酶產生菌。

圖1 菌株菌落形態(A)與水解圈鑒定(B)

2.2 基于16S rDNA的菌株鑒定

對菌株的16S rDNA序列進行的PCR擴增和測序，獲得1408 bp的DNA序列(GenBank登錄號：MH916560)。在線BLASTN比對，其與Klebsiellasp. SPC06的16S rDNA的一致性達99%。MEGA 6.0軟件構建系統進化樹，結果顯示，本菌與產酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)、格氏勒米諾克雷伯氏菌(K.grimontii)等優先聚合在一起。結合菌株形態特性，確定該菌為克雷伯氏菌屬Klebsiellasp.，命名Klebsiellasp. AKB01。

圖2 基于16srDNA序列的系統發育樹，加粗分支為Klebsiellasp.AKB01；括號中字符為基因登錄號

2.3 菌株AKB01培養條件的優化

不同碳氮源對菌株AKB01生長影響的研究顯示(圖3)，葡萄糖和酵母粉組合條件下菌株生長最快，菌液活菌量8.58*108個·mL-1，其次是蔗糖和酵母粉組合(7.84*108個·mL-1)，淀粉和硫酸銨組合條件下生長最慢(1.40*108個·mL-1)。因此葡萄糖和酵母粉是菌株生長的最適碳氮源。

進一步研究培養溫度和初始pH值對菌株AKB01生長的影響，結果表明(圖4)，菌株的最佳生長溫度為 35℃，低于25℃或高于40 ℃生長速度明顯下降。菌株生長的最適pH為8.0，pH小于5.0或大于9.5時生長幾乎停滯。基于此，得到本研究菌株AKB01的最優培養條件為：1%葡萄糖，0.5%酵母粉，pH 8.0，溫度35 ℃。最優培養條件下，繪制菌種的生長曲線，發現15 h菌株進入對數生長期，35 h后進入穩定生長(圖5)。

圖3 不同碳氮源組合對菌株生長的影響

圖4 不同溫度和起始pH對菌株AKB01生長的影響

2.4 不同金屬離子對菌株堿性果膠酶活性的影響

以5 mmol·L-1二價金屬離子作為輔助劑，測定粗酶液的酶活性，結果對照中，菌株的酶活性僅0.98 U·mL-1，添加不同金屬離子酶活性存在差異(圖6)，添加鈣離子酶活性最高為48.50 U·mL-1，鎂離子時最低為5.39 U·mL-1，符合果膠酸裂解酶的特點[9]。

圖5 菌株AKB01生長曲線

圖6 不同二價金屬離子對酶活性的影響

3結論與討論

本試驗以果膠為唯一碳源從蠶沙中的分離獲得果膠酶產生菌，并利用酶水解透明圈和16S rDNA序列對篩選獲得菌株進行鑒定，命名為Klebsiellasp. AKB01，這也是首次從蠶沙中分離得到分泌果膠酶的菌株，說明在堿性較弱的家蠶中腸后部(pH值8.0-9.0左右)，可能存在產果膠酶菌株，為進一步家蠶對果膠的消化吸收以及家蠶腸道產果膠酶微生物菌群的研究提供了參考。

外源添加家蠶腸道的優勢菌群，也可加強腸道優勢菌群能力，對家蠶全繭量和繭層量等繭絲經濟性狀具有顯著改善。本研究分離菌株AKB01在pH值大于9.5時生長緩慢或停滯，而中腸中部為強堿性環境，對菌株的生長具有抑制甚至滅活作用，因此目前很少有家蠶腸道產果膠酶相關菌的報道。

二價金屬離子是果膠酶發生作用的輔助因子，鈣離子可顯著提高菌株AKB01的堿性果膠酶的活性至48.50 U·mL-1，酶活性稍低于來源于史密斯桿菌產堿性果膠酶的菌株(88U·mL-1)[10]，與枯草芽孢桿菌的酶活性相當45 U·mL-1[11]，高于芽孢桿菌 WSHB04-02(34 U·mL-1)[12]，符合野生菌株的特征。該菌株發酵周期短，為堿性果膠酶的工業化生產奠定了一定的基礎。