獼猴桃葉枯病病原菌廣譜拮抗菌株的篩選與鑒定

付 博，王家哲，張 鋒，李英梅，任 平,2

(1.陜西省生物農業研究所 有害生物監測與防控研究中心，陜西 西安 710043；2.陜西省酶工程技術研究中心，陜西 西安 710600)

陜西省是我國的獼猴桃種植大省，隨著獼猴桃產業的迅猛發展，獼猴桃病害也不斷加重。近年來獼猴桃細菌性葉枯病成為新興的獼猴桃主要病害，研究發現其病原菌為丁香假單胞菌丁香致病變種(Pseudomonassyringaepv.Syringae)，該病主要危害獼猴桃葉片，輕時個別葉片表現出局部枯死癥狀， 重時則大部分葉片干枯死亡，嚴重影響果樹的生長及果實的品質[1, 2]。

傳統的獼猴桃葉枯病防治主要采用化學藥物防治，但由于生產過程中長期大量使用化肥、農藥，果園生態環境嚴重惡化，果樹營養供給不足，果樹自身對各種病蟲害的抗性能力減弱，產品農藥殘留的污染日漸嚴重，并影響了獼猴桃的生產、產品外銷、威脅人的健康和產業的可持續發展[3]。近年來國內外積極探索并采用以微生物為主要拮抗物質進行植物病害防治，通過菌體和植物病害之間的相互作用研究證明了應用生物防治技術保護重要經濟作物是十分可行的，此外生物防治采用微生物菌株作為拮抗物質，具有可擴大培養、節約經濟和沒有副作用的優點[4]。

用于植物病害防治的拮抗微生物種類較多，包括放線菌[5]、芽孢桿菌和假單胞菌等，而由于芽孢桿菌自身能夠產生耐高溫、耐酸堿，抗逆性極強的芽孢而受到廣泛關注并作為生防菌劑被大量投放到實際生產應用中[6, 7]。目前已分離鑒定出來的對獼猴桃葉枯病有拮抗作用的菌種仍十分有限，而且現有菌種的抗病能力良莠不齊，因此，本研究擬從獼猴桃根際土壤中篩選出對獼猴桃葉枯病具有廣譜拮抗作用并且抗性較強的芽孢桿菌并對其進行鑒定。從而不斷豐富現有的拮抗菌株資源，積極促進生物防治技術在提高獼猴桃樹防病、抗病能力方面發揮更大的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 土樣 按常規方法采集陜西眉縣、周至縣和西安臨潼區獼猴桃園果樹根際土壤。

1.1.2 供試病原菌 獼猴桃細菌性病原菌，丁香假單胞菌丁香致病變種(編號1336)(Pseudomonassyringaepv.Syringae)，獼猴桃細菌性潰瘍病病原菌(編號2102)(Pseudomonassyringaepv.actinidae)，菌種來源：購于中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所。植物常見真菌性病原菌，獼猴桃灰霉病病原菌F3(Botrytiscinerea)、黃瓜枯萎病病原菌F5(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、甜瓜枯萎病病原菌F7(Fusarimaxysporiumf.sp.melonis)、蘋果斑點落葉病病原菌F9(Alternariaalternataf.sp.Mali)、辣椒疫病病原菌F11(Phytophthoracapsici)菌種來源：由西北大學生命科學學院微生物實驗室友情饋贈。

1.1.3 主要試劑和儀器 PCR所用Buffer、dNTP、Taq酶等購自北京鼎國生物技術公司，限制性內切酶EcoR I 購自Takara公司，克隆載體pGEM-T Easy購自Promega公司，氨芐青霉素(Amp)、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、瓊脂糖等購自Wolsen公司，細菌基因組DNA提取、質粒提取、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自Biotake公司，其他常規實際均為國產分析純。離心機Centrifuge5415D、Centrifuge5810R、pCR儀、微量可調移液器、電轉化儀 Eleetroporator2510均購自Eppendorf公司，DNA mini購自Heto-Holten公司，凝膠成像系統購自SYNGENE公司，電泳儀購自Bio-RAD公司，恒溫搖床、培養箱、水浴鍋等均為國產儀器。

1.2 菌株分離和篩選

1.2.1 根際土壤中芽孢桿菌的分離篩選 土樣經室溫干燥后稱取25 g放入225 mL含有少量玻璃珠的無菌水振蕩30 min，樣品懸液經80 ℃水浴加熱20 min，取0.1 mL稀釋涂布牛肉膏蛋白胨平板，30 ℃倒置培養48 h，挑取單菌落劃線、編號保藏備用。

1.2.2 具有拮抗作用的菌種初篩 以獼猴桃葉枯病病原菌為拮抗對象，采用抑菌圈法[2]，每個待篩菌株4個重復，并利用SPSS軟件進行生物統計分析[8]。

1.2.3 具有拮抗作用的菌種復篩 為進一步確定無菌發酵液上清對獼猴桃葉枯病病原菌的拮抗作用，搖瓶發酵液12 000 r/min離心10 min，取上清，采用細菌過濾器(0.22 μm)過濾除菌，制備無菌的發酵液上清，采用牛津杯法進行復篩，每個待測菌株設置4組重復，測量抑菌圈直徑，取平均值[2, 9]。

1.2.4 拮抗菌的抑菌譜檢測 以最常見的獼猴桃細菌性潰瘍病病原菌(Pseudomonassyringaepv.actinidae)為檢測對象，采用抑菌圈法檢測菌株拮抗效果；以獼猴桃灰霉病病原菌F3(Botrytiscinerea)、黃瓜枯萎病病原菌F5(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、甜瓜枯萎病病原菌F7(Fusarimaxysporiumf.sp.melonis)、蘋果斑點落葉病病原菌F9(Alternariaalternataf.sp.Mali)、辣椒疫病病原菌F11(Phytophthoracapsici)5種常見的植物真菌性病害為檢測對象，采用平板對峙法檢測菌株拮抗效果，30 ℃培養5 d，測量真菌圓形菌落邊緣為起止的直徑，以未接拮抗菌的真菌平板為對照，計算抑菌率[2, 10]。

抑制菌=

1.3 菌株鑒定

1.3.1 菌體形態觀察及生理生化實驗 篩選出對獼猴桃葉枯病具有廣譜拮抗作用的菌株并參照文獻[11]方法觀察菌體形態并測定生理生化特征。

1.3.2 16S rDNA序列測定 使用Biotake細菌基因組DNA提取試劑盒抽提菌體基因組DNA，采用細菌鑒定通用引物27F(正向引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)/1492R(反向引物：5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)進行16S rDNA的PCR擴增。PCR擴增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min、57.5 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，30個循環；72 ℃ 10 min。擴增產物用Biotake柱式DNA凝膠回收試劑盒進行切膠純化。切膠純化產物連接pGEM-T Easy載體，電轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，通過藍白篩選得到陽性質粒轉化子，提取質粒并進行EcoR I單酶切驗證，將質粒送上海生工進行測序，序列提交NCBI網站獲得GenBank登陸號[12-13]。

1.3.3 系統發育樹的構建 將菌株16S rDNA序列通過BLAST與NCBI網站GenBank中已知的序列進行同源性分析，利用DNASTAR(MegAlign)將序列進行對位排列，并手工適當校正，MEGA3.1分析堿基組成，并以Kimura22參數計算遺傳距離，采用Nj鄰近法構建系統進化樹[14]。

2 結果與分析

2.1 對獼猴桃葉枯病有拮抗作用的芽孢桿菌初篩

按上述方法，從獼猴桃根際土壤中共分離出31株對獼猴桃葉枯病病原菌(編號1336)有拮抗作用的芽孢桿菌，其中抑菌圈直徑大于0.5 cm占總數的82%(圖1)。

圖1 菌株MX3-11對獼猴桃葉枯病病原菌的拮抗作用

2.2 對獼猴桃葉枯病有拮抗作用的芽孢桿菌的復篩

以初篩的對葉枯病病原菌(編號1336)有拮抗作用的31株芽孢桿菌為研究對象，檢測拮抗菌株的發酵液上清對致病菌的抑制作用。結果顯示，初篩的拮抗菌中有3株菌MX3-11、TJKB-24和NF2的無菌發酵液上清對葉枯病病原菌(編號1336)具有明顯的抑制作用，抑菌圈直徑均>0.5 cm(表1)。

表1 發酵液上清對病原菌的抑制作用

2.3 菌株抑菌譜檢測

采用直接點樣法和平板對峙法檢測已篩選的菌株對獼猴桃潰瘍病病原菌和其他5種常見真菌性病原菌的拮抗作用，結果顯示，菌株MX3-11、TJKB-24和NF2對獼猴桃潰瘍病病原菌的抑菌圈直徑大于0.5 cm占總數的80%；對真菌性病原菌均表現出不同程度的拮抗能力(表2)，這3株菌對F5黃瓜枯萎病病原菌的抑制作用最強，抑菌率均大于60%，而對F9蘋果斑點落葉病病原菌的抑制作用較低，均小于33%。說明菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的抗菌譜較廣，具有較大的應用潛力。

表2 抑菌率的計算

圖2 菌體及芽孢顯微攝影(100倍)

2.4 菌株的鑒定

2.4.1 菌株形態和生理生化特征 菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的各項基本特征均表現出高度的一致性，菌株均為革蘭氏陽性桿菌，大小約0.87 μm ～1.18 μm×2.50 μm ～6.00 μm，好氧，周生鞭毛，產芽孢，菌落圓形、表面光滑、乳白色(圖2)。3株菌體的生理生化特征相同見表3。

表3 菌株生理生化特征

2.4.2 菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的16S rDNA序列分析及菌種鑒定 菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的16S rDNA序列長度分別為1 449 bp、1 450 bp和1 452 bp。將序列提交NCBI基因庫，獲得GenBank登陸號分別為KC495121、KC495122和KC495120。以菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的16S rDNA 序列為基礎構建系統發育樹(Nj樹)，結果顯示這3株菌與美麗短芽孢桿菌位于同一個進化分枝，同源性100%。因此，鑒定菌株MX3-11、TJKB-24和NF2均為美麗短芽孢桿菌(Brevibacillusformosus)。[15-16]

圖3 以菌株MX3-11、TJKB-24和NF2的16SrDNA序列為基礎的系統發育樹

3 結論與討論

隨著獼猴桃葉枯病的主要病原菌被確定，人們逐步開展拮抗菌種選育工作以期能夠篩選出具有生物防治作用的生物菌劑，從而達到對獼猴桃病害的田間防治目的。李娟[2-3]從獼猴桃根際土壤分離篩選出2株對獼猴桃葉枯病病原菌具有拮抗作用的菌種，分別鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和巨大芽孢桿菌(Bacillusmegatherium)，通過田間小試試驗研究證實了菌株的抗病作用十分有效。楊靈紅[17]將對獼猴桃葉枯病具有拮抗作用的巨大芽孢桿菌進行了He-Ne激光誘變，將菌株的拮抗能力提高了26.61%。目前，國內主要針對獼猴桃葉枯病的生防菌劑研究僅限于這三篇報道，而國外暫未見相關報道。

筆者研究從獼猴桃根際土壤中篩選出菌株MX3-11、TJKB-24和NF2，其對獼猴桃葉枯病病原菌具有明顯的拮抗作用，此外對獼猴桃潰瘍病病原菌、常見真菌性病原菌也具有較強抑菌效果，抗菌譜較廣。這3株菌能夠代謝產生胞外活性物質，菌株的無菌發酵液上清對獼猴桃細菌性病原菌抑菌作用明顯，已有報道顯示短芽孢桿菌能夠產生廣譜且種類多樣的次級代謝產物[18]。因此，菌株MX3-11、TJKB-24和NF2具有良好的開發和應用價值。

通過菌體形態、生理生化試驗和16S rDNA序列分析將菌株MX3-11、TJKB-24和NF2均鑒定為美麗短芽孢桿菌(Brevibacillusformosus)。這3株菌的篩選和鑒定極大的豐富了現有的對獼猴桃葉枯病具有拮抗作用的菌種研究，為開發新型拮抗生物菌劑奠定了重要基礎。

1995年美麗短芽孢桿菌(Brevibacillusformosus)被鑒定為新種[15]，然而多年來尚未見該菌種的生防研究報道，但是近幾年國內外研究人員正初步開展短芽孢桿菌屬的抗病促生機制研究[19-21]，這些研究成果將為探索美麗短芽孢桿菌(Brevibacillusformosus)的生物拮抗機理提供重要的借鑒，從而積極促進對該菌種的全面而深入的研究。