非洲紫羅蘭花梗高頻再生體系的建立

李 鶯，張玉姣、瞿亞梅、屈 雯、楊帥帆

(西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，秦嶺野生觀賞植物研究中心，陜西 西安 710065)

非洲紫羅蘭(SaintpauliaionanthaWendl)又名非洲苦苣苔，系苦苣苔科多年生常綠宿根草本花卉。非洲紫羅蘭品種繁多，其株型小巧，花色多種多樣，一年開花3～4次，是深受大眾喜愛的觀賞花卉之一，非洲紫羅蘭一般在人工栽培條件下，授粉率結(jié)實(shí)率很低，不易得到種子，且其繁殖周期長，不能滿足市場的大量需求，因此，采用組培快繁是解決其繁殖的有效途徑之一[1]。

目前，有關(guān)非洲紫羅蘭的研究主要集中于組織培養(yǎng)、生理生化、花色機(jī)理、栽培管理和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等方面。我國從20世紀(jì)80年代到現(xiàn)在一直在開展非洲紫羅蘭的組織培養(yǎng)及工廠化育苗的研究工作，但主要集中在以其葉片為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)[2]，而采用花梗進(jìn)行離體培養(yǎng)方面的研究未見報(bào)道，因此我們在前人研究的基礎(chǔ)上，采用花梗為外植體進(jìn)行離體組織培養(yǎng)，以期獲得高頻的再生體系。

1 材料與方法

材料引自陜西省西安市朱雀花卉市場，品種'Diana'。

1.1 外植體的消毒與培養(yǎng)

選取適量非洲紫羅蘭的總花梗作為外植體置于燒杯中，用紗布封口后流水沖洗3h，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺。先在70%乙醇中浸泡10s，無菌水中沖洗2次，然后用2%的次氯酸鈉溶液滅菌5 min，再用無菌水沖洗3次，用無菌濾紙將消毒完成的外植體上的殘留液體吸干。花梗切成0.5～1 cm左右的小段，接種后將培養(yǎng)皿放置在PQX-330A-22H多段人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，光照12 h·d-1，光照強(qiáng)度40～50 mol m-2s-1，光照培養(yǎng)溫度為25±1℃，暗培養(yǎng)溫度為18±1℃，培養(yǎng)濕度為60%。

1.2 初代培養(yǎng)

將微量元素中的硫酸錳減少到1/4的改良MS作為為基本培養(yǎng)基，將已消毒的花梗切成小段接種在以下四種培養(yǎng)基中：① 改良的MS+1.0 mg·L-16-BA + 0.1 mg·L-1IBA(以下單位相同)；② 改良MS+6-BA2.0+ IBA0.2；③ 改良MS+6-BA1.0 +NAA0.1；④ 改良MS+6-BA2.0+NAA0.2。每組培養(yǎng)基接種6個(gè)培養(yǎng)皿， 每個(gè)培養(yǎng)皿接種4～6個(gè)小段，觀察并統(tǒng)計(jì)出愈率。

出愈率=(誘導(dǎo)出愈傷組織外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%

1.3 繼代培養(yǎng)

將誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體進(jìn)行繼代培養(yǎng)，在③號改良MS+ 6-BA1.0 + NAA 0.1培養(yǎng)基，上進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)，觀察并統(tǒng)計(jì)出芽率及增殖系數(shù)。出芽率=(誘導(dǎo)出不定芽外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%，增殖系數(shù)=繼代后的芽苗數(shù)/繼代前的芽苗數(shù)。

1.4 生根培養(yǎng)

將已長出4片及以上真葉的不定芽挑出接種在以下生根培養(yǎng)基中：⑤ MS+ NAA0.1；⑥ MS+ NAA0.5；⑦ MS+NAA0.5+ IAA0.5，觀察并統(tǒng)計(jì)生根率。

生根率=(生根的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%

1.5 煉苗移栽

選取生長健壯、生根良好的試管苗，打開瓶蓋，煉苗3～5 d。移栽于草炭和蛭石1：1的基質(zhì)上，統(tǒng)計(jì)其成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 初代培養(yǎng)

將總花梗分別接種到四組培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30 d觀察到花梗誘導(dǎo)出少量愈傷組織，愈傷組織緊密，黃綠色，60 d統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

表1 不同激素配比對花梗誘導(dǎo)愈傷組織的影響

30 d，四組培養(yǎng)基中總花梗均誘導(dǎo)出少量愈傷組織，其中③號最先出現(xiàn)緊密型愈傷組織。60 d觀察，①號培養(yǎng)基內(nèi)僅有少量水浸狀愈傷組織且有輕微褐化，如圖1-a；②號培養(yǎng)基內(nèi)愈傷組織不明顯，大部分褐化，如圖1-b；③號培養(yǎng)基內(nèi)所有花梗均誘導(dǎo)出淺綠色緊密型愈傷組織，即出愈率100%，且愈傷組織形態(tài)飽滿充盈，沒有褐化現(xiàn)象，如圖1-c；④號培養(yǎng)基內(nèi)僅有少量愈傷組織，但已有芽分化，部分外植體完全褐化，誘導(dǎo)出少量愈傷組織后均分化出不定芽，所以出愈率和出芽率均為77.8%，如圖1-d。

實(shí)驗(yàn)表明：③號培養(yǎng)基是總花梗誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基，④號培養(yǎng)基是總花梗快速誘導(dǎo)芽分化的較適培養(yǎng)基。

2.2 繼代培養(yǎng)

將總花梗誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)移至③號即改良的MS+6-BA1.0+NAA0.1上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。30 d觀察，所有的繼代的愈傷組織均分化出不定芽，出芽率高達(dá)100%，且每塊愈傷組織平均分化5～6個(gè)芽，60 d則觀察每塊可高達(dá)50～60個(gè)芽，增殖系數(shù)近10倍，增殖的不定芽葉片極小，如圖1-e.f。因此，改良的MS+6-BA1.0+NAA0.1是優(yōu)質(zhì)的芽增殖培養(yǎng)基。

2.3 生根培養(yǎng)

將繼代增殖培養(yǎng)產(chǎn)生不定芽小苗接種到3種生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。30 d統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

表2 不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑生根的影響

30 d時(shí)，三組培養(yǎng)基內(nèi)的所有不定芽均已生根。其中⑤號培養(yǎng)基，不定芽明顯增高，較纖細(xì)，葉片微卷，基部少量褐化，根濃密較短；⑥號培養(yǎng)基中，不定芽植株矮小，葉片形狀不規(guī)則，大葉極大，小葉極小，根濃密較短，⑦號培養(yǎng)基中，植株矮小，基部少量褐化，根毛濃密。由表4可看出，三組培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)不定芽生根，因此， NAA在0.1～0.5 mg·L-1范圍內(nèi)均適宜誘導(dǎo)生根。

2.4 煉苗移栽

選擇生長一致的試管苗，移栽于草炭和蛭石1:1的基質(zhì)上,60 d后統(tǒng)計(jì)其成活率高達(dá)95.33%，見圖1-h。

3 討論與結(jié)論

多數(shù)關(guān)于非洲紫羅蘭的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中都選擇了葉片作為外植體,幼嫩葉片是優(yōu)良的外植體[1]。例如黃靖[3]在使用葉片和莖段作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，35 d葉片誘導(dǎo)率為100%，而莖段為0%；吳麗芳[4]等人的研究表明，70 d葉片的誘導(dǎo)率達(dá)64.7%，葉柄的誘導(dǎo)率僅有8.4%，而以其花梗為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的研究未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上采用總花梗作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：非洲紫羅蘭的總花梗也是一種適合于組培快繁的外植體。

圖版1非洲紫羅蘭花梗組織培養(yǎng)

a.①號培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織；b.②號培養(yǎng)基誘導(dǎo)導(dǎo)愈傷組織；c.③號培養(yǎng)基誘導(dǎo)導(dǎo)愈傷組織；d.④號培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽； e增殖培養(yǎng)1; f增殖培養(yǎng) 2; g誘導(dǎo)不定芽生根 h煉苗移栽的試管苗

初代培養(yǎng)中所使用的四組培養(yǎng)基中，通過比較①、③組和②、④組，在6-BA濃度相同的情況下，6-BA與NAA配比出愈率高于6-BA 與IBA配比，說明6-BA與NAA的配比組合是最適宜的。這與張曉軍[5]等人的實(shí)驗(yàn)表明6-BA與NAA的搭配優(yōu)于KT與NAA的搭配及ZT與NAA的搭配，即6-BA與NAA配比組合是最適宜的觀點(diǎn)一致。而比較①、②組和③、④組，隨著6-BA濃度由1 mg·L-1增加到2 mg·L-1時(shí)，NAA或IBA由0.1 mg·L-1增加到2 mg·L-1時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率反而下降，說明， 6-BA1.0 mg·L-1與NAA0.1 mg·L-1為誘導(dǎo)愈傷組織的最適配比，與黃靖[3]、趙興兵[6]、耿明清[7]等人的結(jié)論一致。

總之，非洲紫羅蘭的花梗是理想的外植體。改良的MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA培養(yǎng)基既適宜初代培養(yǎng)又適宜繼代培養(yǎng)，初代培養(yǎng)出愈率高達(dá)100%，繼代培養(yǎng)中可再分化不定芽，出芽率100%，在改良的MS+ NAA0.1-0.5 mg·L-1范圍均可誘導(dǎo)生根，生根率100%，試管苗移栽到草炭和蛭石1:1的基質(zhì)上成活率高達(dá)95.33%。