膠體金免疫層析法快速檢測牛奶中環丙沙星殘留

于璐，劉衛華，劉敏軒，楊森，王甜瑩，王向紅

（河北農業大學食品科技學院，河北保定071001）

環丙沙星（ciprofloxacin，CIP）屬氟喹諾酮類（fluoroquin-olones，FQNs）藥物[1]，是一種人獸共用藥，屬廣譜殺菌藥，是目前獸醫臨床應用的氟喹諾酮類中對革蘭氏陰性菌的抗菌活性最強的一種。同時其對革蘭氏陽性菌、支原體厭氧菌、綠膿桿菌亦有較強的抗菌作用[2-3]。此外環丙沙星還是恩諾沙星的主要代謝產物。恩諾沙星同屬于氟喹諾酮類化學合成抑菌劑[4]，是一種動物專用氟喹諾酮類廣譜抗生素，多用于畜禽、水產養殖過程中動物疾病的預防和治療，但是恩諾沙星在動物體內有較長的半衰期，會在動物體內代謝為仍有殺菌作用的環丙沙星[5-6]。有文獻指出給乳牛靜注2.5 mg/kg 恩諾沙星，停藥 0.5、1、2、4、6、8、24、48 h 后，乳汁中恩諾沙星濃度逐漸降低，環丙沙星濃度逐漸升高，在8 h 時達到峰值然后降低，該研究證明恩諾沙星在體內很快被代謝為環丙沙星，后者在乳汁中將存留較長時間[7]。并且歐盟對食品中FQNs 殘留限量做了嚴格的規定，我國農業部235 號公告也針對該類藥物制定了相關的標準，規定恩諾沙星和環丙沙星共同限量100 μg/kg[8]。

隨著恩諾沙星在畜牧和水產養殖中的應用。對恩諾沙星的代謝產物環丙沙星進行監測，在保障食品安全、保護人群健康等方面具有重要意義[9]，此外建立環丙沙星的檢測方法能在一定程度上反映恩諾沙星的使用情況。目前，環丙沙星殘留的檢測主要采用液相[10-11]、液相質譜儀[12-14]和其他儀器方法[15-17]，但是儀器法價格昂貴，前處理方法復雜，需要專業的人員，不適用于大量樣本的快速篩查及現場篩查。免疫分析方法具有較高的靈敏度和特異性，與色譜分析方法檢測結果一致性較高，樣品前處理過程簡單，檢測時間短，不需要大型昂貴的檢測設備并且對操作人員專業性要求不高[18]。劉烜等[19]建立的膠體金免疫層析法快速喹諾酮類藥物殘留主要是針對組織樣品，未對牛奶樣品進行檢測。何丹婷等[20]建立的牛奶中恩諾沙星和環丙沙星檢測試紙檢測限略高，因此，本研究采用膠體金作為標記材料，采用競爭抑制原理。建立了一種高靈敏度的膠體金免疫層析法檢測牛奶樣品中的環丙沙星。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛奶：市購。

環丙沙星抗血清：河北農業大學食品營養與安全實驗室自制；環丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）、依諾沙星（enoxacin，ENO）、氧氟沙星（ofloxacin，OFL）：上海源葉科技有限公司；氯金酸、牛血清白蛋白（Bovine albumin，BSA）、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）、四甲基聯苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-Hydroxysuccinimide，NHS）：美國 Sigma 公司；N，N'-二環己基碳二亞胺（dicyclohexylcarbodiimide，DCC）：阿拉丁化學有限公司；羊抗兔IgG：北京索萊寶有限公司；硝酸纖維素膜：德國Sartorius 公司。

HM3030/HM3035 XYZ 三維劃膜噴金儀、CTD300/CTS300/CTS300B 全自動切條機：上海金標生物科技有限公司；JB-2 型恒溫磁力攪拌器：上海一恒電子科技有限公司；GNP-9050 恒溫培養箱：上海精密試驗設備有限公司；MK3-1500 多功能酶標儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；TDL-5 冷凍離心機：上海Anke。

1.2 方法

1.2.1 環丙沙星包被抗原的制備

稱取20.6 mg 環丙沙星溶于1 200 μL 的二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，再依次加入 15.4 mg 的NHS 和 28.1 mg 的 DCC，室溫（25 ℃）避光振蕩 5 h，放于4 ℃條件下過夜，記為A 液。稱取10.0 mg 的卵清蛋白（OVA 溶于 2 mL 0.1 mol/L NaHCO3溶液中，記為 B液。將A 液的上清液逐滴加到B 液中，使B 液一直處于冰水混合物中振搖，直到有沉淀生產時停止滴加，冰浴振蕩2 h 以上，然后于4 ℃條件下反應過夜。把反應后的混合溶液轉入透析袋中，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）（0.02 mol/L，pH7.4）進行透析，以3 次/d 的頻率換液，連續透析3 d，透析完成后放于-20 ℃中保存備用。

1.2.2 環丙沙星抗體制備及表征

采用ProteinA-sephoarse 4B 親合層析柱對環丙沙星抗血清進行純化處理，在4 ℃條件下采用PBS 緩沖液透析3 d，可以得到接近分析純的抗體。

采用間接酶聯免疫分析（enzyme-linked Immunosorbent assay，ELSA）測定抗體效價：用碳酸鹽包被緩沖液（0.05 mol/L，pH 9.6）包被抗原，用 PBS 溶液倍比稀釋抗體，OD 值1.0 左右的抗體稀釋倍數為抗體效價，并作為最佳稀釋度。使用間接競爭法確定抗體IC50值：包被條件為 10 μg/mL 每孔 100 μL，標準品母液 1mg/mL，再用PBS 梯度稀釋至 100 000、10 000、1 000、100、1、0.01、0.001 ng/mL，PBS 做空白對照進行抑制試驗，以環丙沙星濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，建立抗體抑制標準曲線，確定抗體IC50值。抑制率計算公式如下：

抑制率（IC50）/%=[1-（OD樣品-OD空白）/（OD對照-OD空白）]×100

1.2.3 標記材料的制備

通過用檸檬酸三鈉還原HAuCl4·3H2O 制備膠體金溶液。在恒溫加熱磁力攪拌器上加熱并攪拌，將3 mL的1 %檸檬酸三鈉儲備溶液加入到100 mL 沸騰的0.01%氯化金三水合物溶液中。當混合物的顏色變為紅色時，將混合物再煮沸5 min 冷卻至室溫（25 ℃），加入雙蒸水定容至100 mL。獲得的膠體金溶液在4 ℃下儲存直至進一步使用。

1.2.4 免疫金的制備

1.2.4.1 膠體金標記抗體蛋白最適K2CO3用量的確定

將膠體金溶液分別加入不同量的0.1 mol/L K2CO3來調節適宜的pH 值。各取100 μL 上述溶液于酶標板中（3 個平行）同時設對照，每孔加入3 μg 環丙沙星抗體，混勻于室溫25 ℃靜置15 min，然后每孔加入20 μL 10%NaCl 溶液（對照加去離子水），混勻后于525 nm波長下測定OD 值并作圖。

1.2.4.2 膠體金標記最佳抗體蛋白濃度的確定

分別向1 mL 已調節好pH 值的膠體金溶液中中加入不同濃度的抗體，使其終濃度分別為0、3、6、9、12、15 μg/mL，混合后加入 100 μL 10 % NaCl 溶液，反應1 h 后于525 nm 波長下測定OD 值并作圖。

1.2.4.3 膠體金標記抗體蛋白的制備及純化

在磁力攪拌下，然后將抗體快速加入到調節到適宜pH 值的膠體金溶液中。將混合物在室溫（25 ℃）條件下繼續攪拌10 min，然后逐滴加入20 μL 20%BSA 再攪拌10 min，將溶液在9 000 r/min 條件下離心50 min，沉淀物用 200 μL 含有 5%蔗糖、0.5%BSA、0.5%Triton-100 和0.03%疊氮化鈉的0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）重懸。將制備的金標抗體溶液 5 μL/孔凍干在微孔板中，并在4 ℃條件下保存。

1.2.5 試紙條制備

用PBS 溶液稀釋環丙沙星包被抗原和山羊抗兔IgG 至 1、0.4 mg/mL，以 1 μL/cm 包被在硝酸纖維素膜（NC 膜）上作為檢測線（T 線）和質控線（C 線），37 ℃干燥1 h。在PVC 膠板上依次裝貼樣品墊、NC 膜和吸水紙，用切條機裁剪成4 mm 試紙條，干燥避光保存。

1.2.6 試紙條檢出限的確定

用標品稀釋液配制一系列濃度的環丙沙星標準品溶液：1.56、3.12、6.25、12.5、25 ng/mL，取 80 μL 標準品溶液用于微孔板中孵育3 min。然后加樣，觀察試紙條顯色情況，以檢測線顏色與空白對照檢測線顏色有明顯差別時的最低標準品濃度作為試紙條檢出限。

1.2.7 試紙條實際樣品的檢測

1.2.7.1 樣品基質的消除

取10 mL 牛奶置于離心管中，于3 500 r/min 離心10 min，除去脂肪，取 5 mL 依次加入 150 μL 0.36 mol/L亞鐵氰化鉀與1 mol/L 硫酸鋅，每次加入后漩渦混合振蕩5 min；3 500 r/min 離心10 min，取上清，將上清用PBS 分別稀釋 0、2、4、8 倍。

1.2.7.2 樣品添加回收試驗

樣品牛奶經驗證不含環丙沙星，作為空白基質進行添加回收試驗。添加環丙沙星使牛奶樣品的終濃度分別為 50、25、12.5 ng/mL，在經過 1.2.7.1 的處理，稀釋適宜的稀釋倍數，觀察回收結果。

1.2.8 ELISA 法驗證試紙條有效性

用河北農業大學食品營養與安全實驗室建立的ELISA 方法對加標牛奶樣品進行定量檢測，以確保試紙條使用的準確性和可行性。

2 結果與討論

2.1 抗體的表征

純化后測得抗體濃度為1.36 mg/mL，間接ELISA 測得抗體效價為1 ∶6 400，抗體IC50值為135.64 ng/mL。競爭標準曲線見圖1。該抗體與交叉反應結果見表1。

圖1 環丙沙星間接競爭ELISA 標準曲線（n=3）Fig.1 Standard curves for CIP in indirect competitive ELISA（n=3）

表1 環丙沙星及3 種結構類似物的IC50 值和交叉反應率Table 1 IC50 and cross-reactivity values for three structural analogues of CIP with the icELISA method

環丙沙星與其結構類似物均未見明顯的交叉反應，故使用抗體進行后續免疫層析試驗。

2.2 標記材料的質量鑒定

本試驗制備的膠體金澄清透明，呈酒紅色，表面無漂浮物，可初步得知所制備的膠體金顆粒大小均勻，質量較好。

2.3 膠體金與環丙沙星抗體最適pH 值的確定

由于膠體金會對pH 計造成損壞，所以本文用K2CO3溶液的用量來代表pH 值，既能方便表達還能有效的調節pH 值。如圖2 所示，1 mL 膠體金溶液與抗體結合最適K2CO3的用量為25 μL。

圖2 最佳標記pH 值選擇Fig.2 Best mark pH value selection

2.4 膠體金與環丙沙星抗體最適蛋白量的確定

1 mL 膠體金溶液所需要的環丙沙星抗體最適量見圖3。

圖3 標記最佳蛋白量的選擇Fig.3 Selection of labeled optimum protein

當抗體蛋白用量小于9 μg 時，吸光值隨著抗體蛋白用量的增大而增加；當抗體蛋白用量等于或大于9 μg/mL 時，吸光度值趨于平衡。即抗體蛋白用量為9 μg/mL 時，與膠體金結合最佳。

2.5 試紙條檢出限的確定

配制一系列濃度的標準品溶液，采用優化出的最佳條件組裝試紙條，隨著標準品濃度的升高，試紙條檢測線顏色逐漸變淺直至消線。標準品濃度依次是25、12.5、6.25、3.12、1.56、0 ng/mL，膠體金標記抗體的試紙條結果如圖4 所示。

圖4 環丙沙星膠體金試紙條檢出限的確定Fig.4 The detection limit of colloidal gold strips for CIP

當濃度為6.25 ng/mL 時，與對照試紙條檢測線顏色有明顯差別，檢測線顏色隨著環丙沙星添加濃度的增大而逐漸變淺。當濃度為12.50 ng/mL 時，T 線完全消失。經過多次重復試驗，最終確定所建立的膠體金標記免疫層析試紙條方法在實際樣品中的檢出限為6.25 ng/mL。

圖5 樣品不同稀釋倍數顯色結果Fig.5 The resulits of different dilution for the milk

2.6 試紙條實際樣品的檢測

2.6.1 樣品基質的消除

樣品不同稀釋倍數的顯色結果見圖5。

經過1.2.7.1 處理的牛奶樣品不經稀釋會導致試紙條失效，用PBS 稀釋2、4、8 倍試紙條條帶顯色清晰，顯色效果與對照接近，即基質影響已基本消除。由于稀釋倍數會影響樣品檢測的靈敏度，所以選用2 倍稀釋作為最終的稀釋倍數以消除樣品基質的影響。

2.6.2 實際樣品的測定

向牛奶陰性樣品中分別添加環丙沙星標準標品使其終濃度為分別為 25.00、12.50、6.25、0 ng/mL，按要求對樣品處理后進行檢測，每份樣品重復3 次，結果如圖6 所示。

圖6 牛奶樣品添加回收結果Fig.6 The recovery experiments result of spiked milk

當加標濃度為12.50 ng/mL 時與對照有明顯的差異，25.00 ng/mL 時T 線完全消失，所以牛奶樣品的最低檢出限為12.50 ng/mL。

2.7 ELISA 法驗證試紙條有效性

通過將ELISA 方法和試紙條結果相比較，從而驗證試紙條的準確性。結果如表2 所示，試紙條在檢測范圍內與ELISA 方法保持一致，結果準確可靠。

表2 牛奶中不同環丙沙星添加水平ELISA 結果與試紙條測定結果比較Table 2 Comparation of results obtained by ELISA and strips at three spiked level

3 討論與結論

環丙沙星屬于小分子物質，采用競爭抑制法對其進行檢測，建立環丙沙星膠體金免疫層析的方法。本文制備環丙沙星包被抗原，對環丙沙星抗體進行表征，優化膠體金標記條件，選用最佳標記pH 值為7.5左右，即需要添加25 μL 0.1 mol/L K2CO3調節pH 值，最佳蛋白添加量為9 μg/mL。方法對牛奶樣品的檢出限為12.50 ng/mL。該試紙條成本低廉，穩定性良好，樣品前處理簡單，點樣后10 min 后裸眼即可判定結果，檢測結果和ELISA 方法一致，故本研究開發的免疫層析試紙條可用于現場快速篩查。