甘蔗葉中黃酮類化合物的分離鑒定及含量測定

張金玲，鄧家剛，劉布鳴，黃艷，Yunjiang Feng，侯小濤，*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530200；2.農(nóng)作物廢棄物功能成分研究協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西南寧530200；3.廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530022；4.澳大利亞格里菲斯大學(xué)Eskitis藥物研究所，澳大利亞布里斯班4000）

甘蔗（Saccharum sinensis Roxb.）為常見的經(jīng)濟(jì)作物和傳統(tǒng)藥物，屬禾本科（poaceae；gramineae）甘蔗屬（saccharum），在世界各地廣泛種植和分布。甘蔗在中國有悠久的藥用歷史，以稈、汁入藥，中醫(yī)認(rèn)為其有除熱止渴、和中、寬膈、行水的功效[1-2]。甘蔗皮、甘蔗渣、甘蔗葉皆可藥用，在廣西有用甘蔗葉煮水制成甘蔗葉茶飲用的習(xí)慣，可用于治療盜汗[3]。甘蔗葉為產(chǎn)量巨大的甘蔗的副產(chǎn)物，但目前為止對(duì)甘蔗葉的應(yīng)用和研究較少。黃酮類化合物是一種在自然界廣泛存在的活性物質(zhì)，具有抗氧化、清除自由基[4]、抑菌、抗病毒[5]、抗腫瘤[6]、降血糖[7]、抗炎[8]、鎮(zhèn)痛[9]等多種藥理活性。研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物為甘蔗葉的主要化學(xué)成分類別之一，苜蓿素為甘蔗葉黃酮類化合物的主要成分，具有抗氧化[10]、抗腫瘤[11]、抑菌[12]等生物活性，本試驗(yàn)從甘蔗葉中提取分離苜蓿素，并測定不同栽培品種甘蔗葉中苜宿素的含量，為開發(fā)和利用甘蔗葉提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100 高效液相色譜儀 [含在線真空脫氣機(jī)器（G-1322A），智能化柱溫箱（G-1316A），可變波長檢測器（G-1313A），Agilent1100 series 色譜工作站]、Agilent 8453 紫外可見分光光度計(jì)：美國安捷倫科技有限公司；Bruker Avance Ⅲ-500 超導(dǎo)核磁共振波譜儀：美國Waters 公司；BP211D 電子分析天平：德國賽多利斯公司；LG-16W 高速微量離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；SB2200-T 超聲波清洗器：上海必能信公司；DJ-1500Y粉碎機(jī)：上海頂佳工貿(mào)有限公司；優(yōu)普UPC-Ⅱ-10T 純水儀：四川優(yōu)普超純科技有限公司；DZKW-S-4 電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 試藥

硅膠GF254、高效薄層色譜板、硅膠G、硅膠H：青島海洋化工廠；SephadexTM LH-20 凝膠：瑞典Amersham Pharmacia Biotech AB；甲醇、乙腈（色譜純）：美國Fisher 試劑公司；其他試劑均為分析純。不同栽培品種的甘蔗葉藥材，共9 批，分別為新臺(tái)糖22 號(hào)、桂糖26號(hào)、桂糖03-2287、桂 31 B9、桂糖 02-1156、桂糖 02-901、云蔗 16 號(hào)、贛蔗 18 號(hào)、福農(nóng) 15 號(hào)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)寧小清高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為禾本科植物甘蔗（Saccharum sinenses Roxb.）的葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 甘蔗葉中苜蓿素的分離與鑒定

2.1.1 提取與分離

甘蔗葉晾干后粉碎，稱取10.4 kg 分?jǐn)?shù)次提取，以95%乙醇為提取溶劑，回流提取3 次（第一次提取前浸泡 12 h），每次 2 h，料液比為 1∶10、1∶10、1∶8（kg/L），放冷，濾過，合并濾液，減壓回收溶劑，得乙醇提取浸膏。將浸膏用水懸浮后，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑，得浸膏石油醚部位83.4 g，二氯甲烷部位36.6 g，乙酸乙酯部位124.5 g，正丁醇部位173.1 g。取乙酸乙酯部位124.5 g 浸膏與190 g 硅膠拌樣，濕法裝柱，上樣，進(jìn)行硅膠柱層析色譜分離，洗脫劑為二氯甲烷∶甲醇（體積比分別為1 ∶0、80 ∶1、40 ∶1、30 ∶1、10 ∶1、5 ∶1、3 ∶2、0 ∶1）梯度洗脫，分離得到 11 個(gè)流分（Fr1～Fr11）。將 Fr8（27.282 7 g）經(jīng)聚酰胺柱色譜分離，乙醇-水溶劑系統(tǒng)（體積比分別為10 ∶90、30 ∶70、50 ∶50、70 ∶30、95 ∶0）梯度洗脫，得到13 個(gè)流分（Fr8-a～Fr8-m），將Fr8-l（1.559 5 g）經(jīng)凝膠柱色譜分離，溶劑系統(tǒng)二氯甲烷-水=1 ∶1（體積比）洗脫，得到 10 個(gè)流分（Fr8-l-1～Fr8-l-10），其中 Fr8-l-4揮干溶劑后經(jīng)重結(jié)晶得到化合物1（34 mg）。

2.1.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 為淡黃色粉末，易溶于水，F(xiàn)eCl3顯色為黃色，濃硫酸顯色為黃褐色，提示該化合物為黃酮類化合物。氫核磁共振波譜法（nuclear magnetic resonance spectroscopy，1H-NMR）（CD3OD，500 MHz）中，低場區(qū)有 4 個(gè)氫信號(hào)，其中，δ6.19（1H，d，J=1.9Hz）與δ6.55（1H，d，J=1.9Hz）相互偶合，為一個(gè)間位取代苯環(huán)中的兩個(gè)芳香氫質(zhì)子信號(hào)；δ7.32（2H，s）為另一個(gè)苯環(huán)上的兩個(gè)質(zhì)子信號(hào)；δ6.98（1H，s）為雙鍵質(zhì)子信號(hào)，3.85（6H，s） 為兩個(gè)甲氧基質(zhì)子信號(hào)，δ12.96（1H，s）、10.81（1H，s）、9.33（1H，s）為羥基質(zhì)子信號(hào)。碳核磁共振波譜法（nuclear magnetic resonance spectroscopy，13C-NMR）（CD3OD，125 MHz） 中共有 14 個(gè)碳信號(hào)，δ181.9 為酮羰基碳信號(hào)，除10 個(gè)苯環(huán)碳信號(hào)和2 個(gè)雙鍵碳信號(hào)外，高場區(qū)的δ56.4 為甲氧基信號(hào)。碳、氫數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道的基本一致，數(shù)據(jù)歸屬如表1 所示，文獻(xiàn)測定溶劑為CD3OD，鑒定該化合物為苜蓿素（tricin），化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

2.2 苜蓿素的純度檢測

2.2.1 供試品溶液的制備

取苜蓿素10.5 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，配制成濃度為1.05 mg/mL的供試品溶液，備用。

2.2.2 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）色譜條件

Phenomenex C18 色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水（54 ∶46，體積比）；體積流量為1 mL/min 檢測波長為350 nm；柱溫為20 ℃；進(jìn)樣量為 10 μL。

表1 化合物1 的1H-NMR 和13C-NMR 數(shù)據(jù)Table 1 1H-NMR 和13C-NMR data of compound 1

圖1 苜蓿素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of tricin

2.2.3 檢測方法和結(jié)果

將“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液在“2.2.2”項(xiàng)色譜條件下平行檢測3 次，計(jì)算供試品中苜蓿素的峰面積。結(jié)果表明，甲醇空白溶劑對(duì)純度檢查無干擾，3 次峰面積均大于98 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.14%，平均值達(dá)到99.6%，見圖2。

3.1 污水排放系數(shù) 污水排放系數(shù)是污水處理工程設(shè)計(jì)的關(guān)鍵參數(shù)，農(nóng)村地區(qū)污水排放系數(shù)范圍較大。北京市城鄉(xiāng)結(jié)合部、平原和山區(qū)村莊的污水排放系數(shù)分別為0.6～0.9、0.3～0.7和0.2～0.6[10]，安徽省農(nóng)村平均產(chǎn)污系數(shù)為0.57[11]。對(duì)2個(gè)海島污水處理量和用水量統(tǒng)計(jì)，得到各月份污水排放系數(shù)如圖3所示。

2.3 苜蓿素的含量測定

2.3.1 藥材前處理

將9 個(gè)不同栽培品種的甘蔗葉自然晾干，粉碎后過100 目篩，得到9 批甘蔗葉粉末，置于干燥器中備用。

圖2 苜宿素對(duì)照品的HPLC 圖譜Fig.2 HPLC of tricin

2.3.2 供試品溶液的制備

分別取按照2.3.1 方法制備的9 個(gè)批次的甘蔗葉藥材粉末2 g，精密稱定，置100 mL 錐形瓶中，分別加入80%乙醇40 mL，搖勻，加熱回流（85 ℃）提取3 次，每次120 min，放冷，濾過，濃縮至干燥，用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至 2 mL 容量瓶中，定容，搖勻，過 0.45 μm 濾膜，即得。

2.3.3 色譜條件

Phenomenex C18 色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水（54 ∶46，體積比）；體積流量為1 mL/min；檢測波長為350 nm；柱溫為20 ℃；進(jìn)樣量為 10 μL。

2.3.4 對(duì)照品溶液的配制

精密稱定苜蓿素對(duì)照品2.6 mg，置25 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，制得濃度為0.104 mg/mL的對(duì)照品溶液，備用。

2.3.5 線性范圍考察

精密吸取“2.3.4”項(xiàng)下苜蓿素對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 分別置 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，各進(jìn)樣 10 μL 測定，按“2.3.3”項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣檢測，以苜蓿素濃度（X）為橫坐標(biāo)，以苜蓿素的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程 Y=349 965.3X-5.9（r=0.999 9），結(jié)果表明苜蓿素在濃度0.005 2 mg/mL～0.031 2 mg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取苜蓿素對(duì)照品溶液10 μL，按2.3.3 項(xiàng)下的色譜條件檢測，重復(fù)進(jìn)樣6 次。結(jié)果，苜蓿素峰面積RSD 為0.15%，表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取新臺(tái)糖22 號(hào)甘蔗葉藥材粉末2.00 g，按2.3.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、10、12 h 在“2.3.3”項(xiàng)色譜條件下檢測。結(jié)果，苜蓿素含量的RSD 為1.29%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取新臺(tái)糖22 號(hào)甘蔗葉藥材粉末共6 份，每份2.00 g，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.3”項(xiàng)色譜條件下檢測。結(jié)果，苜蓿素含量RSD 為0.68%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取苜蓿素對(duì)照品3.90 mg，置于50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為苜蓿素對(duì)照品儲(chǔ)備液A。取已知含量（苜蓿素含量為0.156 0 mg/g）的甘蔗葉藥材粉末約1 g，精密稱定，共6 份，分別在6 份供試品中加入1 mL 的苜蓿素對(duì)照品儲(chǔ)備液A。按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.3”項(xiàng)色譜條件下檢測，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。由表2 可知，該方法的回收率良好。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 2 Results of recovery test（n=6）

2.3.10 樣品含量的測定

按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.3”項(xiàng)色譜條件下檢測，結(jié)果見表3 和圖3。

3 結(jié)果與結(jié)論

本試驗(yàn)建立了HPLC 法測定甘蔗葉中苜蓿素含量的方法，在測定的9 個(gè)樣品中，新臺(tái)糖22 號(hào)含量最大為0.152 5 mg/g，桂糖26 號(hào)含量最小為0.080 46 mg/g。含量測定結(jié)果顯示不同栽培品種的甘蔗葉中苜蓿素的含量有較大的差異。本試驗(yàn)結(jié)果對(duì)開發(fā)甘蔗葉藥用價(jià)值具有一定的實(shí)際意義。

續(xù)表3 不同栽培品種甘蔗葉中苜蓿素的含量（n=3）Continue table 3 Contents of tricin in different batchs of Saccharum sinensis Roxb.leaves（n=3）

圖3 不同栽培品種甘蔗葉的HPLC 圖譜Fig.3 HPLC of different batches of Saccharum sinensis Roxb.leaves

苜蓿素為首次從甘蔗葉中分離得到的黃酮類化合物，課題組在甘蔗葉藥理活性研究中發(fā)現(xiàn)甘蔗葉具有抑菌、抗腫瘤、降血糖、抗炎等藥理活性[4-8]，研究發(fā)現(xiàn)苜蓿素具有抗氧化[10]、抗腫瘤[11]、抑菌[12]等生物活性，因此苜蓿素可能是甘蔗葉抑菌、抗腫瘤的一種活性成分之一。