豬抗凝全血樣品檢測非洲豬瘟時凝膠產生原因及避免措施探討

羅嘉軒，馮云云

（1.江門市動物疫病預防控制中心廣東 江門 529051；2.華南農業大學獸醫學院 廣州 510642）

隨著非洲豬瘟的防控工作進入常態化和長期化的階段，檢測非洲豬瘟的數量和頻率也在上升[1]。在生豬調運、供港供澳、常規監測以及流行病學調查等工作中常常都會采集豬的抗凝全血樣品，而根據中國動物衛生與流行病學中心和中國動物疫病預防控制中心于2018 年8 月聯合編制的《非洲豬瘟病毒檢測操作規程（試行）》，檢測樣品應在60℃水浴30min 進行病毒滅活。

在滅活過程中樣品常出現凝膠，難以通過移液槍吸取，影響實驗進行[2]。為了解凝膠產生原因，更好地為實驗開展提供參考，筆者對380 份豬全血樣品進行分析。

1 材料和方法

1.1 樣品來源、抗凝劑及狀態

樣品共360 份，來源為廣東省江門市及陽江市的供港豬場，其中280 份來自于江門市，80 份來自于陽江市。樣品均由相同的人員進行采集，采樣人用注射器采集后保存于抗凝管中，抗凝劑為EDTA、肝素鈉和枸櫞酸鈉。樣品和冰袋一同放置于泡沫箱中進行送樣，接樣時樣品狀態正常，呈液體狀，無凝膠、沉淀物產生。

1.2 樣品檢測方法

用一次性巴氏吸管吸取樣品到1.5mL 離心管中，10,000r/min 離心3min，用一次性巴氏吸管把上清液轉移到新1.5mL 離心管中，用干式恒溫金屬浴進行60℃30min 金屬浴滅活病原，觀察樣品形態。

1.3 樣品分組情況

樣品分為三組。第一組樣品于2019 年6 月3 日采集，共180份，來自9 個豬場，其中7 個來自于江門市，2 個來自于陽江市，樣品采集后放置于-20℃保存，次日進行血清分離。第二組和第三組于2019 年6 月17 日采集，兩組共180 份，來源場和第一組相同，其中有100 份于17 日當天進行血清分離，為第二組，另外80 份保存于4℃并于18 日進行血清分離，為第三組。

2 結果

離心前三組樣品均為液態，其中第一組顏色與第二、第三組相比偏黑。離心后第一組呈液態、顏色均勻、無明顯上清液產生，第二和第三組明顯分層，上層為澄清液體，下層為沉淀物，其中第三組顏色較第二組偏紅。

金屬浴滅活后，第一組基本都呈現暗黑色凝膠狀半固體，部分凝固程度較高的樣品用移液槍吸取樣品有困難，第二和第三組均呈液態，用移液槍吸取操作無障礙。

3 結果分析

第一組和第二、第三組耗材及樣品采集方式、采集人員相同，可排除采樣人員、耗材因素對結果影響。第一組和第三組的樣品來自相同的場，樣品的保存時間相同，保存溫度不一致，結果第一組均產生凝膠，第三組均未產生凝膠，足以證明在零度以下環境保存是產生凝膠的關鍵原因之一。

第二組和第三組的保存溫度相同，保存時間不一樣，而兩組均未產生凝膠，也可從側面反映保存時間的差異與凝膠的產生相關性不大。而第一組凝膠主要在金屬浴后產生，樣品在金屬浴之前均為液態，金屬浴后均為凝膠態，形成自身前后對比，證明金屬浴是產生凝膠的關鍵原因之一。

由于在實驗中證明了在零度以下環境保存和金屬浴兩者為凝膠產生的必要因素，缺一不可。故推測有可能是樣品保存于零度以下環境時，紅細胞細胞膜由于結冰而破裂釋放出血紅蛋白，隨后金屬浴時加熱使蛋白質發生變性，氫鍵等次級鍵被破壞，形成沉淀以及粘度增加，導致凝膠產生。

4 避免措施

由于缺乏豬全血非洲豬瘟陽性樣品，尚不知凝膠的產生對檢測結果是否有影響，但其粘稠度較大，影響實驗操作，故在實際工作中應采取措施來避免凝膠的產生。主要的措施有注意采樣送樣的時效性以及采樣后盡快進行血清分離，如果不能當天進行分離，應于2～8℃進行冷藏保存，避免在0℃以下環境保存。