蘋果果皮著色的研究進展

遲 馨 王心悅 宋來慶 姜中武 杜曉云*

（1 煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺264005；2 山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，煙臺265500）

蘋果中含有豐富的礦質(zhì)元素和維生素，是生活中最常見和主要的水果之一。我國是世界上最大的蘋果生產(chǎn)國， 目前， 蘋果栽培面積227.23 萬hm2，產(chǎn)量4 400 萬t，接近世界總水平的50%。 但我國蘋果產(chǎn)業(yè)整體質(zhì)量水平不高，優(yōu)果率較低。蘋果果皮的著色和果肉中糖酸含量是影響蘋果品質(zhì)的主要因素，果實大小和顏色是決定蘋果收購價格的主要因素。因此，通過育種和栽培措施提高蘋果果實著色，是目前生產(chǎn)上亟需的技術(shù)措施。提高果實著色技術(shù)和色澤調(diào)控機制，是目前的研究熱點。前人研究結(jié)果表明，蘋果著色受花青苷、類胡蘿卜素等自身生理指標(biāo)含量，和溫度、光照等外界環(huán)境多因素影響。本文系統(tǒng)總結(jié)了花青苷、葉綠素和類胡蘿卜素等生理指標(biāo)，以及花青苷代謝、調(diào)控等相關(guān)的MYB 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子以及甲基化等分子因素對蘋果著色的影響，以期為后續(xù)蘋果果皮著色研究提供參考。

1 影響蘋果果皮著色的生理因素

蘋果的色澤發(fā)育是一項復(fù)雜的生理過程，影響蘋果果皮色澤的主要生理因素包括花青苷、葉綠色、類黃酮和類胡蘿卜素，這些化學(xué)物質(zhì)本身含量以及相互之間的作用， 影響了蘋果果皮色澤。根據(jù)色澤將蘋果分類，可以分為紅色、黃色和綠色品種。花青苷使蘋果的果皮表現(xiàn)出紅色， 葉綠素使蘋果果皮表現(xiàn)出綠色，類胡蘿卜素使蘋果果皮表現(xiàn)出黃色。在這幾種影響因子中， 花青苷對蘋果果皮色澤的影響作用最大。

1.1 花青苷蘋果果皮呈現(xiàn)的紅色與花青苷代謝密切相關(guān)。花青苷的合成與花青苷合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因及轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)，花青苷的積累受溫度、光照、套袋等措施的影響。目前所知花青苷主要通過類黃酮的合成途徑生成，在合成過程中主要受2 種基因調(diào)控，一種是在編碼合成的過程中相關(guān)酶的結(jié)構(gòu)，一種是在結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)過程中起調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子基因。研究結(jié)果表明，蘋果中的糖分為果皮中的花青苷提供了前體物質(zhì)，著色期果皮中的花青苷含量和果實中可溶性糖含量呈極顯著正相關(guān)，和蘋果PAL 酶、CHI 酶、淀粉酶活性呈極顯著正相關(guān)。蘋果中淀粉酶、蔗糖酸性轉(zhuǎn)化酶活性的改變可以促進蘋果中糖的生成，從而促進花青苷的生成；同時，蘋果PAL 酶、CHI 酶含量的增加也可以促進花青苷的進一步累積。 套袋紅富士蘋果，在解袋后花青苷的生成和果實的內(nèi)源激素含量關(guān)系密切，如乙烯可以控制下游基因MdLDOX 和MdUFGT 的表達(dá)， 從而影響蘋果成熟期花青苷的含量。脫落酸與S3307 對蘋果果皮花青苷含量以及果肉可溶性糖含量有明顯的促進作用。 外界環(huán)境也能影響花青苷的生物合成，不同的光照強度對蘋果果實花青苷的影響不同，當(dāng)光照強度在40%～85%時，蘋果中花青苷的含量會隨著光照強度的增加而增加，于洪華等在著色調(diào)查的同時測定蘋果的花青苷含量也發(fā)現(xiàn)，蘋果果皮花青苷含量與著色面積的增長趨勢一致；紫外光是花青苷合成最佳的光質(zhì)，藍(lán)光效果次之，白光幾乎沒有效果，遠(yuǎn)紅光效果最差，甚至?xí)种苹ㄇ嘬盏暮铣伞Ｔ谏a(chǎn)實踐中，人們采用延長摘袋之后果實的光照時間、摘遮光葉、適當(dāng)轉(zhuǎn)果以及鋪設(shè)反光膜等措施， 使蘋果果皮中的花青苷在解袋之后迅速積累， 從而促進蘋果果皮的全面著色。

1.2 葉綠素研究表明，富士蘋果套袋與不套袋兩種處理后，果皮中的葉綠素含量從6 月20日起呈上升趨勢，7 月20 日達(dá)到高峰，隨后開始下降（不同地區(qū)在時間上會有差異），套帶蘋果比不套袋蘋果下降速度快，葉綠素總含量不套袋蘋果較套袋高。套袋和不套袋蘋果葉綠素含量發(fā)生變化，原因在于蘋果袋阻擋了光照，從而使果皮中綠素分解黃化，而黃化之后的果皮組織光敏色素會比一般的組織高，果皮組織就會對光照反應(yīng)更加敏感，從而促進花青苷的合成，當(dāng)蘋果生長發(fā)育期花青苷的含量積累到一定水平后，葉綠素含量高時，蘋果呈現(xiàn)暗紅色，含量低時呈現(xiàn)鮮紅色，因此，生產(chǎn)中采用套袋技術(shù)，使其中的葉綠素含量顯著降低，從而使蘋果表現(xiàn)出鮮紅色。

1.3 類胡蘿卜素是使蘋果果皮呈現(xiàn)黃色的主要物質(zhì)。實驗表明，蘋果套袋20 d 后類胡蘿卜素含量和葉綠素含量會持續(xù)下降，當(dāng)花青苷開始合成時，類胡蘿卜素和葉綠素的含量達(dá)到最低，在解袋第1 d 到解袋第10 d 的總含量差異不大，未套袋的蘋果果皮中類胡蘿卜素的含量近乎恒定。同時，套袋與未套袋蘋果對比結(jié)果表明，套袋會抑制類胡蘿卜素的生成，加快果實中已有的葉綠素的分解，當(dāng)蘋果解袋之后，在光照的作用下，花青苷含量增加較快，而類胡蘿卜素、葉綠素含量變化不明顯，使蘋果果皮沒有底色的干擾，從而顏色鮮艷。生產(chǎn)中可以根據(jù)需求采用不同的技術(shù)促進或抑制這幾類物質(zhì)的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)蘋果果皮的著色，套袋后的蘋果花青素含量是不套袋的1.3 倍。

2 影響蘋果果皮著色的分子因素

2.1 MYB 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子目前，在蘋果果皮著色研究中，發(fā)現(xiàn)的最多通過調(diào)控花青苷的合成從而影響著色的轉(zhuǎn)錄因子，主要包括MYB、bHLH(MYC)和WD40 三類，這3 類轉(zhuǎn)錄因子通過MYB-bHLH-WD40(MBW)復(fù)合體形式，來調(diào)控蘋果果皮中與花青苷合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響蘋果果皮的著色。 其中，MYB 轉(zhuǎn)錄因子是在植物體內(nèi)廣泛存在的多基因家族，種類眾多，在植物中具有多種多樣的功能及作用，如植物的抗逆性、抗衰老以及生長發(fā)育等；bHLH 主要是充當(dāng)橋梁的作用，同時還可以和MYB 互相作用。研究者通過全基因組分析確定了229 個與蘋果相關(guān)的MYB 基因，并將其分成45 個亞群，通過相關(guān)的基因組數(shù)據(jù)庫分析后，了解MYB 家族在蘋果中的概況。 在MYB 家族數(shù)百的種類中，目前被證明在蘋果果皮著色中產(chǎn)生作用的有MdMYB1、MdMYB10 和MdMYBA 等少數(shù)的幾類，在蘋果果皮花青苷的合成過程中起重要的調(diào)控作用。其中，MdMYB1 主要調(diào)控蘋果果皮中花青苷合成，MdMYB10 主要調(diào)控紅肉蘋果果肉中花青苷的合成， 且MdMYB1 啟動子的甲基化水平在套袋蘋果中有一個顯著的降低現(xiàn)象，表明對果皮著色具有一定的影響和調(diào)控。MdMYB1b與MdMYB1-1 是蘋果成熟期控制花青苷合成的主要基因，而MdMYB1a 則在蘋果幼果期花青苷的合成中發(fā)揮重要的作用。研究者還從蘋果中分離出能夠調(diào)控蘋果花青苷合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子MdMYB10， 發(fā)現(xiàn)MdMYB10的表達(dá)量可以誘導(dǎo)花青素的積累，從而與花青苷的合成密切相關(guān)， 同時Myc 家族中bHLH蛋白的研究表明，其也是調(diào)控花青素合成的重要轉(zhuǎn)錄因子，例如MdMYB10 與MdbHLH3 和MdbHLH33 的協(xié)同互在煙草中可促進花青苷的積累。其它轉(zhuǎn)錄因子，如NAC 和MADS box等也能夠調(diào)控花青苷的合成，進而影響果實著色。生產(chǎn)中運用套袋技術(shù)，在套袋期間降低了與蘋果果皮中花青苷合成相關(guān)的MdCHI、MdF3H、MdDFR、ANS、MdUFGT 等結(jié)構(gòu)基因和MdMYB1、MdMYB10、MdbHLH3、MdbHLH33等調(diào)控基因的表達(dá)水平，來降低了花青苷合成過程中相關(guān)酶的活性，從而降低了花青苷的含量， 因而蘋果在袋內(nèi)生長期花青苷的含量極少，蘋果幾乎不著色，蘋果成熟解袋之后，蘋果果皮中的花青苷迅速積累，蘋果迅速著色。

2.2 甲基化目前所知，DNA 的甲基化包括兩種，一種是從頭甲基化，即兩條鏈均被甲基化；另一種是維持甲基化，即DNA 雙鏈中的一條鏈被甲基化， 另一條未被甲基化。 研究表明，DNA 的甲基化對于維持植物的正常發(fā)育十分必要，DNA 的去甲基化容易引起植物的非正常發(fā)育， 甲基化在植物逆境脅迫中的作用也相繼被證實。 近幾年在分子研究領(lǐng)域興起的熱點， 表觀遺傳研究中最為熱衷的甲基化是指胞嘧啶C5 位上的甲基化修飾。蘋果基因中啟動子區(qū)域的甲基化程度能夠影響RNA聚合酶以及轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合， 從而促進轉(zhuǎn)錄的進行，影響基因的表達(dá)，從而影響花青苷的合成。未套袋蘋果和套袋蘋果解袋10 d 之后，果皮中MdMYB1 啟動子區(qū)段-2 026 bp～-1 870 bp都發(fā)生明顯的甲基化，且甲基化程度套袋低于未套袋， 表明MdMYB1 啟動子片段甲基化水平的降低導(dǎo)致了蘋果果皮的著色， 該片段在調(diào)控MdMYB1 啟動子過程中有著重要的作用。 此外， 研究發(fā)現(xiàn)對于不同色澤類型的蘋果，MdMYB1 啟動子上與果皮著色相關(guān)的關(guān)鍵甲基化修飾區(qū)段存在明顯的差異， 綠色品種蘋果解袋之后花青苷合成能力最弱，MdMYB10 的甲基化水平也顯著降低；黃色品種蘋果解袋之后花青苷合成能力較差， 實驗組的甲基化水平?jīng)]有顯著變化； 紅色蘋果解袋之后花青苷合成能力最強， 并且甲基化水平在不同的區(qū)段中表現(xiàn)出不同程度的顯著降低。錢敏杰也對不同材料上PpMYB10 基因啟動子區(qū)域的甲基化水平進行了相關(guān)數(shù)據(jù)分析，分析結(jié)果表明，紅色材料的甲基化水平明顯高于綠色材料， 這也證明甲基化水平對果實著色有一定的影響作用。目前，對于甲基化在蘋果果皮著色上的研究依然較少， 需要進一步的實驗論證。

3 討論與展望

現(xiàn)有研究結(jié)果表明，蘋果的著色主要受到花青苷的影響， 在蘋果的成熟期解袋之后蘋果果皮中的花青苷含量在短期間內(nèi)迅速上升，大量積累的花青苷與葉綠素、類胡蘿卜素共同作用，使蘋果果皮呈現(xiàn)鮮紅色。而影響蘋果果皮中花青苷合成與積累的因素有很多，例如環(huán)境的影響，溫度、陽光等，生產(chǎn)中的套袋等技術(shù)就是利用溫度、 陽光等控制蘋果果皮中的花青苷含量， 當(dāng)蘋果解袋之后， 在陽光、 溫度的影響下花青苷迅速積累， 蘋果短期內(nèi)迅速上色。 葉綠素與類胡蘿卜素在使蘋果呈現(xiàn)綠色和黃色的過程中發(fā)揮同樣的作用，蘋果成熟期解袋之后，葉綠素和類胡蘿卜素的含量都持續(xù)下降， 當(dāng)花青苷含量達(dá)到最高時，與花青苷共同作用，使蘋果表皮呈現(xiàn)鮮紅色。

在分子層次上，本文通過對相關(guān)文獻的分析總結(jié)發(fā)現(xiàn)，目前大部分的研究集中在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能夠影響花青苷的合成轉(zhuǎn)錄因子MYB、bHLH(MYC) 和WD40 三類， 它們通過YBbHLH-WD40(MBW)復(fù)合體形式參與蘋果果皮中花青苷的合成，MdMYB10 與MdbHLH3 和MdbHLH33 協(xié)同表達(dá)有利于蘋果果皮中花青苷的積累，有利于蘋果果皮的著色。

對于近幾年的研究熱點分子甲基化，在其它物種上的研究已經(jīng)很多。目前發(fā)現(xiàn)甲基化在相關(guān)植物抗逆性以及品質(zhì)提升方面具有重要的作用，但在蘋果果皮著色中甲基化的作用及影響研究較少。目前的研究表明，花青苷的合成過程會受到相關(guān)調(diào)控基因的DNA 甲基化程度的影響，調(diào)控因子啟動子區(qū)域甲基化程度越高，相關(guān)的表達(dá)水平越低，甲基化在MYB 轉(zhuǎn)錄子中的作用機理，通過對轉(zhuǎn)錄子的影響來控制花青苷的合成。總之，隨著DNA 甲基化在各種植物中的作用以及在不同情況下發(fā)生的變化被相繼鑒定出來，DNA 甲基化的功能也將會被更多的利用在生產(chǎn)實踐中。