木犀草素抗炎機制的研究進展

于倩，巫冠中

(中國藥科大學藥理教研室，江蘇 南京 210009)

木犀草素是存在于許多藥用植物中的黃酮化合物，是植物中最豐富的次級代謝產物之一，并且具有各種藥理活性。木犀草素(3,4,5,7-四羥基黃酮)作為一種天然黃酮類物質，存在于多種蔬菜，水果和藥用植物中，其中包括西蘭花、洋蔥葉、胡蘿卜、辣椒、卷心菜、蘋果皮和菊花等[1]。據報道，木犀草素具有抗氧化，抗微生物，抗炎，化學預防，化學治療，心臟保護，抗糖尿病，神經保護和抗過敏的特性[2]。木犀草素的多種藥理活性被證實與其抗炎作用有關。同時，含有高木犀草素含量的中藥一直在伊朗和巴西用于治療炎癥相關的疾病[3]。

天然來源的化合物通常是先導化合物的一部分。事實上，目前有100多種天然產物的衍生藥物正在進行臨床試驗[4]。 黃酮類化合物，特別是來自多種具有傳統治療作用植物中木犀草素，其抗炎活性一直廣受關注。此外，由于木犀草素在微摩爾濃度下即顯示較強的抗炎活性[5]，因此它已成為一種潛在的抗炎化合物，可用于進一步開發。一些研究報道了木犀草素的構效關系，以確認其發揮抗炎作用的機制，但是其發揮抗炎作用的相關機制尚未完全闡明，本文將對木犀草素的抗炎機制予以綜述。

1 氧化應激

在炎性環境下，氧化應激和炎癥是相互依賴和相互關聯的共存關系。炎性細胞在炎癥部位釋放活性氧(ROS)，導致氧化損傷。同時，過多的ROS和氧化應激產物會進一步增強促炎反應[6]。木犀草素作為一種天然類黃酮化合物，其結構含有一定數目的酚羥基，使其具有較強的還原性，從而具有抗氧化特性。研究證實木犀草素可作為ROS清除劑，抑制ROS的產生并活化相關的抗氧化酶。同時，木犀草素可以通過減少一氧化氮合酶(iNOS)的合成，從而減少NO的生成[7]。Seelinger等[5]認為木犀草素可以通過抑制iNOS的作用，iNOS的表達和一氧化氮(NO)的生成。

據報道，在腫瘤壞死因子(TNF-α)誘導造成人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)損傷后使用木犀草素處理，HUVECs中乳酸脫氫酶(LDH)合成減少，超氧化物歧化酶(SOD)活性增強和細胞內谷胱甘肽(GSH)水平升高，從而抑制TNF-α誘導的ROS的產生(6)。在脂多糖(LPS)和叔丁基氫過氧化物(t-BHP)誘導的巨噬細胞中，木犀草素以濃度依賴性方式抑制ROS和NO的生成[8]。還有在來自在來自Sprague-Dawley(SD)大鼠的骨髓來源的巨噬細胞中，木犀草素以劑量依賴性方式抑制TNF-α和IL-6的產生，并縮短了TNF-α和IL-6 mRNA的半衰期[9]。

此外，一些研究人員對木犀草素和其他物質的聯用進行了研究。 木犀草素和橘皮素的聯用對LPS刺激的NO產生良好的抑制活性，并且兩者之間具有協同作用[10]。 對前列腺素E2(PGE2)，白介素(IL)-1β和IL-6的產生也觀察到這種協同抑制[10]。 橘皮素和木犀草素單獨使用時均會抑制iNOS和環加氧酶-2(COX-2)mRNA的表達水平，橘皮素和木犀草素的聯用后對這兩種酶mRNA的表達水平抑制更強[10]。與木犀草素和菊苣酸的聯用也可協同抑制RAW264.7細胞中的iNOS、環氧化酶-2(COX-2)、TNF-α和IL-1β的產生[11]。總之，大量研究表明木犀草素可以通過減少活性氧和活性氮的產生，從而發揮抗炎作用。

2 細胞因子

在炎癥反應期間，免疫細胞可以分泌多種類型的介質，其中包括細胞因子(例如干擾素、白介素和腫瘤壞死因子)、趨化因子(例如單核細胞趨化蛋白1)、類十二烷酸(例如前列腺素和白三烯)等[12]。這些炎癥介質可以消除侵入的外來病原體并啟動免疫調節。但在慢性炎癥的發展過程中，長期高水平的促炎介質可造成細胞和組織不同程度的損傷[13]。無論是急性炎癥還是慢性炎癥，細胞因子都在其中發揮著至關重要的調節作用[14]。在緩解炎癥的過程中，減少炎性細胞因子和炎癥介質的生成并抑制其相關功能是極其重要的，抗炎藥物的主要作用之一便是能夠調節炎性介質。木犀草素的抗炎作用一部分是通過調節炎癥介質實現的，并在多種體內和體外模型中顯示其調節炎性因子和炎癥介質的作用。木犀草素能夠抑制IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、TNF-α、干擾素(IFN)-β和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，并且能夠提高IL-10(一種抗炎細胞因子)的水平。此外，木犀草素還可以抑制能夠控制免疫細胞遷移和定位的趨化因子(如：CCL2、CXCL2、CXCL8和CXCL9)等[15]。

3 花生四烯酸代謝途徑

目前已知花生四烯酸至少有3條代謝通路，而木犀草素對其中環氧化酶和脂氧酶兩條通路均有不同程度的影響。花生四烯酸可通過COX-1/2先形成不穩定的環內過氧化物(PGG2和PGH2),然后在多種酶的作用下生成兩類化合物：前列腺素類(如PGE2和PGD2)和血栓素類(如TXA2和TXB2)。在炎癥反應中，PGE2可通過調節免疫細胞的分化或增加相關細胞因子的表達起到促炎作用，從而加劇炎癥反應[16]。而PGD2作為一種促炎因子，可以促進炎癥發生，并在哮喘的發病過程中發揮至關重要的作用[17]。多個實驗研究表明，木犀草素可通過抑制COX-2的表達從而減少PGE2的生成。同時，木犀草素還可以減少肥大細胞釋放PGD2[18-19]。據報道，小鼠口服木犀草素(10和50 mg·kg-1)可有效抑制角叉菜膠誘導的足腫脹，RT-PCR結果顯示木犀草素是COX-2 mRNA的選擇性抑制劑[20]。在LPS誘導的RAW264.7的細胞內，木犀草素可以顯著抑制COX-2的蛋白表達，且明顯降低PEG2的水平[21]。此外，花生四烯酸也可以由脂氧酶催化生成白三烯，白三烯作為一類具有高度活性的炎癥介質，參與多種疾病進程。而木犀草素可以抑制白細胞三烯(LTB4)的合成并減少肥大細胞釋放白三烯[22]。

4 NF-κB 信號通路

核因子-κB(NF-κB)作為一種重要的轉錄調控因子可以調節多種促炎因子基因的表達，其中包括細胞因子，趨化因子和黏附分子等。在靜息狀態下，NF-κB二聚體與κB抑制蛋白(IκB)形成復合體并以失活狀態存在于細胞質中。當細胞受到刺激后，IκB激酶復合體(IKK)活化后會將IκB磷酸化，使NF-κB從失活狀態活化并暴露核定位位點游離的NF-κB從細胞質轉移到細胞核內，通過與特異性κB 序列結合而誘導靶基因的轉位[23]。NF-κB在炎癥中發揮極其的重要作用，而許多相關研究已證明木犀草素的一部分抗炎作用是通過抑制NF-κB信號傳導實現的。具體來說，木犀草素可以通過作用于多種信號分子，其中包括抑制AKT磷酸化，抑制IκB降解，抑制NF-κB亞基易位，以及改變HDAC和HAT的活性來影響NF-κB信號傳導途徑。

研究發現木犀草素通過減弱IκBα和p65的磷酸化來降低NF-κB的活性。在佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)和A23187共同刺激的肥大細胞(HMC-1細胞)中，木犀草素可以抑制IκBα降解和p65 NF-κB的核轉位[18]。除此之外，在TNF-α刺激的HUVECs中，木犀草素以劑量依賴的方式降低IκBα的磷酸化，并且能夠阻斷部分NF-κB/p65的易位[24]。同時，木犀草素可以通過抑制蛋白激酶B(AKT)磷酸化從而降低炎癥介質的表達。Li等[25]發現木犀草素以濃度依賴性方式降低LPS誘導的AKT磷酸化。另一報道指出，木犀草素可使磷酸化AKT的濃度依賴性降低，而非磷酸化AKT的水平未改變[26]。此外，木犀草素還可以通過改變組蛋白去乙酰化酶(HDAC)和乙酰化酶(HAT)的活性來抑制炎癥。研究報道當THP-1處于高糖環境時，木犀草素通過提高HDAC的活性并降低HAT的活性來抑制NF-κB介導的染色質乙酰化，從而減少細胞因子的轉錄[27]。

此外，木犀草素和菊苣酸的聯用明顯抑制了LPS刺激的RAW 264.7細胞中p65和IκBα的磷酸化[11]。 對木犀草素衍生物的研究表明，木犀草素可以抑制p65和c-Jun的磷酸化，而木犀草素-7-O-葡萄糖苷僅抑制p65的磷酸化;在LPS刺激的RAW264.7細胞中觀察到類似的核轉位(木犀草素可以抑制NF-κB和AP-1的活化，但木犀草素-7-O-葡萄糖苷僅抑制NF-κB活化[28]。 因此，木犀草素比木犀草素-7-O-葡糖苷更強烈地抑制NF-κB的活化[28]。 木犀草素或木犀草素與綠原酸聯用會顯著抑制IL-1β刺激的RSC-364細胞中p-IKKα/β和NF-κBp50水平[27]。總之，木犀草素通過抑制NF-κB的活化來調節NF-κB信號傳導途徑，從而抑制促炎基因表達。

5 MAPK和AP-1信號通路

絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)屬于細胞內一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。據報道，在多種細胞模型中，木犀草素可以調節MAPK信號傳導途徑的多種靶標。在SW982細胞中，觀察到木犀草素可以抑制IL-1β誘導的c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38激酶活化，這證明了木犀草素對MAPK傳導途徑有一定的影響[29]。同時，木犀草素也抑制了IL-1β引起的AP-1核轉位[29]。Kang等[18]報道在PMA和A23187刺激的HMC-1細胞中，木犀草素抗炎通過減少ERK和JNK的活化來抑制促炎細胞因子和細胞內Ca2+釋放。其中細胞內Ca2+水平的增加可通過激活鈣調蛋白和鈣調神經磷酸酶來調節活化T細胞(NFATs)核因子的核轉位[22]。 隨著二酰基甘油(DAG)的產生，Ca2+的積累可以調節蛋白激酶C(PKC)的活化，從而介導下游信號通路的激活，包括MAPK通路和轉錄因子NF-κB[22]。

但是在不同的細胞類型和實驗模型中，木犀草素有時顯示出不同的實驗結果。例如，在LPS刺激的RAW264.7細胞中，Lee等[23]發現木犀草素不抑制JNK或ERK的磷酸化，而且木犀草素對MAPK的活化沒有影響，但卻以時間和劑量依賴性方式降低了LPS誘導的AKT磷酸化。同時，另一研究也認為用木犀草素處理RAW264.7細胞不會改變LPS誘導的MAPK信號傳導，但是卻依然可以觀察到JNK磷酸化降低和下游c-Jun信號傳導的減弱[30]。木犀草素降低了c-Jun和AKT的蛋白質水平，但是對它們的基因水平沒有影響[30]。此外，木犀草素降低了c-Jun和AKT的半衰期，并且阻斷了熱休克蛋白90(HSP90)與AKT的結合。由此，他們認為木犀草素是通過抑制高遷移率族蛋白1(HMGB1)的表達，并抑制c-Jun和AKT的作用來產生抗炎作用[30]。

6 JAK-STAT信號通路

木犀草素可以降低STAT的結合活性，STAT1的磷酸化水平，IRF-1(一種調節促炎細胞因子表達的轉錄因子)的基礎表達水平，并下調因為LPS/γ-干擾素(IFN-γ)刺激所引起的IRF-1表達水平的增加[31]。木犀草素對LPS/IFN-γ刺激所引起的JAK1、JAK2和Tyk2磷酸化沒有顯著影響，但是在BV-2小膠質細胞中觀察到Src磷酸化的減弱[31]。此外，木犀草素處理BV-2小膠質細胞時，細胞因子信號傳導抑制蛋白(SOCS)-3的表達上調，表明木犀草素也可以通過影響這種負調控因子來使STAT1失活[31]。另有報道發現，在細胞因子刺激的HT-29細胞中，木犀草素可以降低全細胞裂解產物和細胞核裂解產物中STAT1(Tyr701)的磷酸化水平[25]。在RAW264.7細胞中，木犀草素顯著下調IFN-γ刺激所引起的COX-2，磷酸化STAT1(Y701)和磷酸化STAT3(Y705)表達的增加;但是STAT1和STAT3總體水平卻保持不變。因此，木犀草素的一部分體外抗炎作用是通過抑制STAT1和STAT3信號傳導途徑實現的[32]。

有研究表明，木犀草素對STAT1和STAT3的抑制具有濃度依賴性。在感染了偽狂犬病病毒(PRV)的RAW264.7細胞中，通過檢測相關炎癥基因(啟動子中具有STAT結合序列)的表達，Liu等[26]發現木犀草素可以降低細胞中IL-6和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的分泌。他們認為木犀草素減少PRV感染的RAW264.7細胞中促炎介質NO，iNOS和COX-2的產生，部分是通過抑制STAT1/3依賴的NF-κB途徑實現的。木犀草素-7-O-葡萄糖苷對STAT3或SIRT的穩態水平沒有影響。類似地，木犀草素-7-O-葡糖苷不影響由IL-22和IL-6處理誘導的STAT3磷酸化[33]。然而，有趣的是，木犀草素-7-O-葡萄糖苷似乎阻止IL-22易位至細胞核[33]，盡管它對STAT的去乙酰化沒有影響[33]。此外，研究發現木犀草素或者木犀草素與綠原酸聯用均可下調p-STAT3的水平，而且JAK1和糖蛋白130(gp130)的水平也顯著下降[27]。

7 肥大細胞

肥大細胞作為免疫系統的一部分，與多種炎癥性疾病密切相關。肥大細胞發揮其生理病理功能是通過釋放一系列的促炎性介質所產生的，這些介質包括組胺，細胞因子，趨化因子和蛋白(包括肥大細胞特異性糜酶和類胰蛋白酶)顆粒[34]。這些炎性介質可進一步加劇反應區域的炎癥進程，因此抑制肥大細胞釋放相關炎性介質可緩解某些炎癥性疾病的發生發展。而木犀草素作為天然黃酮類物質，具有潛在的抗炎抗氧化和抑制肥大細胞的作用。在HMC1(人肥大細胞)中，木犀草素以濃度依賴的方式降低TNF-α、IL-6、IL-8、GM-CSF、TNF-α和COX-2的基因水平和蛋白質水平，并減少細胞內Ca2+釋放，從而抑制肥大細胞釋放顆粒物質[18]。木犀草素也可以抑制大鼠腹膜肥大細胞釋放組胺等物質[35]。研究發現，缺糖缺氧環境會促進MC/9(小鼠肥大式細胞)脫顆粒，但木犀草素和棕櫚酰乙醇酰胺聯用可以明顯抑制MC/9脫顆粒的進行[36]。

8 展望

科研工作者對木犀草素的抗炎活性已進行了大量的研究，并已證明其在多種細胞和動物模型中均表現出顯著的抗炎活性。此外，Theoharides等[37]報道了有關木犀草素臨床試驗的初步研究。他們制造了膳食類黃酮制劑，該制劑主要含有木犀草素(100 mg，來自洋甘菊，純度>95%)、槲皮素(70 mg，來自槐花，純度>95%)和槲皮素糖苷蘆丁(30 mg，來自槐花，純度>95%)，這些化合物配制成微球(脂質體)混合在橄欖仁油中，油酸和含水量低(<0.1%)，這樣會有利于吸收。37名受試者是來自美國各地患有自閉癥譜系障礙(ASD)的兒童(29名男孩和8名女孩，年齡4～14歲)。兒童接受2粒/20 kg體重(每粒膠囊含有200 mg總黃酮)至少持續4周的試驗[37]。這項初步研究顯示，約75%的兒童胃腸道和過敏癥狀顯著改善，50%的兒童注意力得到提升等[37]。這個發現揭示了木犀草素作為抗炎藥用于治療人類疾病的潛在用途，因為腦炎癥與神經精神疾病(包括ASD)的發病機制有關。但是，迄今為止的臨床研究僅限于ASD的臨床評估，因此，其他炎癥相關病癥也必須進行廣泛的研究，例如特應性皮炎，類風濕性關節炎，牛皮癬和克羅恩病。

綜上所述，木犀草素可以通過多種途徑緩解炎癥反應，其中包括減少活性氧和活性氮的生成，影響花生四烯酸的代謝和多種炎性信號通路(NF-κB 信號通路；MAPK和AP-1信號通路；JAK和STAT信號通路)抑制炎性細胞因子和炎癥介質的表達等。但目前我們對木犀草素的研究還存在局限性，一方面其抗炎機制尚未完全闡明，另一方面其安全性亟待充分的毒理學評價。因此通過對木犀草素抗炎機制及其毒理學的進一步研究，有助于為木犀草素成為抗炎新藥提供依據。