環狀RNA在結直腸癌中的研究進展

張宇宏，李云龍，李勝龍綜述 張博淼，黃躍南審校

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的惡性腫瘤，全球范圍內癌癥發病居男性的第2位，女性的第3位[1]。當結直腸癌被檢出時在局限階段的5年生存率為90.1%，癌癥擴散到臨近器官和淋巴結時5年生存率下降到69.2%，當疾病擴散到遠處器官時，5年生存率下降到11.7%，然而只有39%的患者在癌癥局限階段被檢出[2]。因此尋求更有效的早期診斷和治療方式一直是近年來結直腸癌研究領域的熱點。環狀RNA(circular RNA，circRNA)最早被發現于1976年，在這之前一直被當作剪輯錯誤，后被證明是生物體內存在的廣泛多樣的內源性非編碼RNA[3-4]。越來越多的研究表明，環狀RNA在許多疾病的發生發展中具有重要作用，尤其是在結直腸癌中，與結直腸癌的分化、TNM分期及侵襲和轉移相關。篩選特異性環狀RNA可以為結直腸癌提供一個非侵入性的、敏感的診斷方式。深入研究環狀RNA與結直腸癌的關系可以為治療結直腸癌提供一個新方向。本文將結合環狀RNA的生物起源和作用機制，以及結直腸癌研究的最新進展進行綜述，希望對未來結直腸癌的早期診斷和治療提供些許幫助。

1 環狀RNA的生物起源和生物學特性

1.1 環狀RNA的生物起源 環狀RNA最初發現于1976年，之后一直被科學界認為是一種剪輯錯誤的副產物[3-5]，隨著研究的深入以及二代測序技術和分子生物學的發展，大量差異表達的環狀RNA被發現，目前發現的環狀RNA總量巨大，環狀RNA的形成機制和生物功能也逐漸被揭開。環狀RNA是一類長鏈非編碼競爭性內源RNA，它是一種無5'-3'結構和Poly A尾的閉合共價的環狀結構[5]。閉合的環狀結構使環狀RNA結構穩定，可以抵抗RNA酶的降解，大多數環狀RNA的半衰期都在48 h以上，并且廣泛大量存在于組織和外周血中，為其成為潛在的分子標志物提供了可能性[6-7]。與線性RNA的形成不同，環狀RNA主要由外顯子的反向剪輯和跳躍形成[8]。新產生的環狀RNA一般比線性RNAs晚，這表明大多數環狀RNA是在親本基因轉錄后產生的[9]。目前關于環狀RNA形成方式主要有以下幾種：(1)套索結構內含子的直接環化；(2)由套索機制驅動的環化；(3)內含子配對介導的環化反應；(4)由RNA結合蛋白介導的環化反應；(5)由轉運RNA剪接驅動的環化；(6)由核糖體RNA剪接驅動的環化[7, 10]。

1.2 環狀RNA的生物學特性 環狀RNA作為最近研究的熱點，其獨特的生物學特性也逐漸被科研人員所認識。主要有以下幾個特性：(1)穩定性。與其他類型的RNA不同，環狀RNA首尾相連形成環狀結構，沒有poly A尾結構，可以抵抗核酸酶的分解，與其他類型的RNA相比，環狀RNA結構更加穩定[11]。(2)保守性。環狀RNA具有序列保守性，這一特性使其在研究人員做研究時更為準確[7]。(3)大量表達。環狀RNA在哺乳動物體內大量表達，通過高通量測序目前已經發現超過100萬個環狀RNA，某些環狀RNA的表達甚至比相應的線性RNA更多，并且在很多疾病中豐度明顯增加[7, 12]。環狀RNA數量龐大，形成方式又較為多樣，雖然目前已經成為最新的科研熱點并且解開了環狀RNA的部分特性和功能，但仍然需要更深入的研究去了解它的生物學特性。

2 環狀RNA的功能

2.1 作為微小RNA的分子海綿 目前研究得到的環狀RNA功能主要是微小RNA(microRNA，miRNA)的分子海綿，通過影響微小RNA的功能進而影響相應靶基因的表達。環狀RNA上存在大量微小RNA結合位點，可以與微小RNA相互結合，通過海綿吸附作用抑制微小RNA的表達，進而調控細胞內信號傳導通路以及目的基因的表達[13]。Memczak等[14]研究發現，環狀RNA可以形成一類重要的轉錄后調節，環狀RNA主要通過調節RNA及RNA結合蛋白和其結合位點局部游離濃度，進而與其他RNA競爭結合微小RNA和RNA結合蛋白，成為一種轉錄后調節因子。以最近研究的環狀RNA circ-ITCH為例，circ-ITCH在膀胱癌中表達下調，并且低表達的circ-ITCH與膀胱癌患者較差的生存期相關，經驗證circ-ITCH通過對miR-17和miR-224的分子海綿作用，上調miR-17和miR-224的靶基因p21和PTEN的表達，進而參與相關信號傳導通路的調節[15]。circ-ITCH在肺癌的發病中，通過分子海綿功能參與Wnt/beta-Catenin信號傳導通路進而抑制肺癌的發生。其在肝癌、食管鱗狀細胞癌以及卵巢癌等眾多惡性腫瘤中也發揮相類似的分子海綿作用[16-18]。

2.2 環狀RNA的其他功能

2.2.1 蛋白質結合功能：環狀RNA可以通過特定靶點與蛋白質結合，進而影響蛋白質的功能。有研究表明，環狀RNA circ-Foxo3可以作為調試器調節周期蛋白依賴激酶2(CDK2)和蛋白質p21之間的關系進而調節蛋白質-蛋白質相互作用網絡[19-20]。Holdt等[21]的研究發現了環狀RNA一個新的功能，circANRIL通過與核糖體蛋白相互作用抑制核糖體RNA的成熟。環狀RNA還可以與阿格蛋白(argunaute，AGO)結合，進而調控mRNA的轉錄和翻譯過程[14]。蛋白質的功能多種多樣，有研究揭示環狀RNA與蛋白質之間具有相互作用，對于未來蛋白質領域的研究也具有深遠影響。

2.2.2 調節基因表達功能:環狀RNA參與生物體內遺傳信息的轉錄和剪輯過程。環狀RNA可以在與普通mRNA的剪切競爭過程中影響靶基因的表達，可見環狀RNA的上調和下調可以不同程度影響其親本基因的表達[22- 23]。Petkovic等[24]的研究表明動物體內RNA的環化與前體mRNA有競爭抑制關系，以保證組織特異性基因的表達。可見環狀RNA在調節基因表達中也發揮作用。

2.2.3 翻譯功能:環狀RNA攜帶遺傳信息可以行使翻譯功能。最近一項研究表明，乙型肝炎病毒的衛星病毒δ病毒、HBV和HDV的包囊以一個非常規的方式共同產生一個122個氨基酸的病毒蛋白，這項研究支持在哺乳動物體內自然產生的環狀RNA可以被轉錄成蛋白質的假設[25]。研究還發現環狀RNA具有編碼多肽鏈的能力[15]。這個突破性的發現，打破了一直以來人們對于環狀RNA從無功能的轉錄副產物到有功能的調節轉錄因子的認識，環狀RNA可能也具備核酸的翻譯特性。

隨著研究深入，越來越多的功能逐漸被科研人員認識，對于環狀RNA的定義也逐漸得到更新。這些研究擴展了人們的知識，從序列配對的調節器(微小RNA海綿和競爭剪輯)到結構功能類似的蛋白質類調節物質，甚至到作為轉錄本翻譯蛋白質，未來更多的環狀RNA功能將逐步被科學界解開，為疾病的早期診斷以及靶向治療提供新的探索方向。

3 結直腸癌與環狀RNA

科學界對環狀RNA研究在近20年里突飛猛進，二代測序技術以及生物信息學的發展，越來越多的環狀RNA被發現于疾病相關，包括良性心血管疾病、內分泌疾病以及惡性腫瘤等[26-27]，尤其環狀RNA與結直腸癌的關系也成為研究熱點。目前關于環狀RNA和結直腸癌診斷和治療的研究已經取得一些成果。

3.1 環狀RNA在腫瘤發展和侵襲中的作用 環狀RNA在結直腸癌中有顯著的豐度變化，并且與腫瘤轉移、侵襲、淋巴結轉移以及預后等特征密切相關。與正常對照組相比，在結腸直腸癌中，circHIPK3明顯過度表達。實驗研究表明，circHIPK3可以通過隔離多個微小RNA來調節人體細胞的增殖[13]。Bachmayr-heyda等[28]發現與正常組織比較，結直腸癌細胞株和結直腸癌內環狀RNA的豐度少，而環狀RNA的豐度與細胞增殖呈負相關。Wang等[29]的研究表明,Hsa_circ_0000567在結直腸癌組織和癌旁組織中均顯著下調，并且其下調與腫瘤的大小、淋巴結轉移、遠端轉移和TNM分期均呈負相關。敲除Hsa_circ_0000567可以促進體外培養的結腸癌細胞增殖和遷移。另一項研究表明，Hsa_circ_0014717在結直腸癌組織和細胞系中表達均下調，并且表達水平與結直腸癌患者的TNM分期、淋巴結轉移和預后顯著相關，過表達Hsa_circ_0014717可以顯著抑制CRC細胞增殖和集落形成，并誘導體外CRC細胞分化停滯在G0/G1階段，并上調細胞周期抑制蛋白P16的表達進而參與細胞周期的調節[30]。Ji等[31]對結直腸癌組織中環狀RNA進行分析得出，相比較正常結直腸組織，Hsa_circ_001649在結直腸癌組織和CRC細胞系中表達顯著下調，雖然該研究顯示Hsa_circ_001649與性別、年齡、TNM分期以及CEA CA119-9和CA-724無相關性，但值得關注的是在CRC患者手術前和手術后的血清樣本中檢測到術后Hsa_circ_001649的含量顯著上調，并且與分型顯著相關。Zhuo等[32]研究中circRNA0003906在6種CRC細胞系中和122對CRC癌組織和癌旁組織進行即時聚合酶鏈式反應，結果circRNA0003906的表達均下調，并且與淋巴轉移和較差的病理分型密切相關。最近的研究報道表明，circRNA的水平在KRAS突變的結腸癌細胞中顯著減少，并可被輸送到外體，這表明了circRNA可能參與了結腸直腸癌的腫瘤形成[33]。

可見環狀RNA與結直腸癌的發生發展密切相關，有望作為結直腸癌診斷和預測預后的分子標志物，成為結直腸癌基因治療的一個新突破。

3.2 環狀RNA參與結直腸癌內信號傳導通路并影響腫瘤功能 環狀RNA可以通過參與腫瘤內相關信號傳導通路影響腫瘤的發生發展。在動物模型中，來自人類腫瘤異種移植的環狀RNA的數量與腫瘤大小有關。這些數據為研究人員提供了一種新穎獨特的方法，可以將外體環狀RNA應用于結直腸癌的早期發現和預后。細胞內的環狀RNA和細胞外的環狀RNA水平相關，并且環狀RNA在細胞內外的轉移與微小RNA相關，提示環狀RNA與其他調節物質共同參與信號的轉導[13]。Zhu等[34]在對3對CRC癌組織和癌旁組織的測序和分析得出，136個顯著表達和243個顯著下調的環狀RNA，并驗證了基因BANP上5～11個外顯子產生的環狀RNA并命名為circular BANP。在35個CRC癌組織中，用si-circ-BANP轉染CRC細胞可以抑制p-Akt的表達，這為circular BANP參與PI3 K/Akt信號傳導通路的假設提供了證據。Xie等[35]的研究顯示hsa_circ_001569在細胞增殖和結直腸癌侵襲中發揮正性調節作用,hsa_circ_001569被證實是miR-145的分子海綿上調miR-145的功能靶基因E2F5、BAG4和FMNL2。在結直腸癌組織中，circ_001569與miR-145呈負相關，而miR-145與E2F5、 BAG4 和 FMNL2的表達呈負相關。Zhang等[36]發現hsa_circRNA_103809 和 hsa_circRNA_104700在CRC組織中均顯著下調，hsa_circRNA_103809 與淋巴轉移和TNM分期顯著相關，而hsa_circRNA_104700與遠端轉移相關。Huang等[37]發現環狀RNA Circ-ITCH在結直腸癌中表達下調，并通過參與調節Wnt/beta-catenin信號傳導通路而參與癌癥的調節。環狀RNA對微小RNA發揮的海綿作用，可以作為一個控制結腸癌細胞功能的手段，也就是環狀RNA在腫瘤治療方面的潛在應用。

3.3 環狀RNA是潛在的結直腸癌靶點 越來越多的證據顯示了各種新型的環狀RNA和致癌基因的信號通路之間的關系，或者是對結直腸癌細胞具有侵略性和特異性的操縱，這兩者都為未來開發新藥物提供靶點及研究方向，以提高結直腸癌患者的早期診斷率以及存活率。已有的研究證明環狀RNA確實參與了結直腸癌疾病發生發展的細胞內信號傳導通路，未來還有待更深入地研究探索其具體機制并應用于臨床。Hansen等[38]首先在小鼠大腦組織里發現可以吸附到miR-7上作為miR-7的分子海綿，并命名為ciRS-7。miR-7是一個目前研究較為深入的分子，是多個腫瘤相關的信號傳導通路中的關鍵分子，通過PTEN/PI3K/AKT信號傳導通路調節胃癌的發生發展[39]。另一項研究表明，ciRS-7下調可以抑制EGFR和IGF-1R的表達，釋放更多的miR-7，從而顯示出顯著的腫瘤抑制活性[40]。miR-7還是在結直腸癌腫瘤發生過程中的一個關鍵分子。ciRS-7可以綁定到miR-7的目標序列，所以它可以充當微小RNA的海綿抑制miR-7的功能。因此，筆者推測，對ciRS-7的下調可以增強miR-7的腫瘤抑制功能，從而抑制結直腸癌的發展。總之，考慮到ciRS-7在隔離miR-7和積極調節EGFR/RAF1/MAPK信號通路中的重要性，通過調節ciRS-7/miR7軸，抑制或破壞ciRS-7抑制結直腸癌的進展。未來對ciRS-7降解的治療方法的研究有望進一步增強腫瘤抑制功能。

4 小結與展望

在過去的幾年中，人們對環狀RNA的生物合成和分子功能的研究有了很大的進展。但是仍然還有許多未解之謎。目前幾個獨立的證據支持在結直腸癌發生發展中，環狀RNA可以作為微小RNA的分子海綿發揮作用。未來關于靶基因、微小RNA和環狀RNA之間的相互作用，環狀RNA在調節結直腸癌增殖、侵襲、轉移中的作用機制和作為分子標志物和基因治療的原理和可行性，需要更系統和深入地研究和分析。確定參與結直腸癌腫瘤發生的眾多功能性的環狀RNA，探索它們的功能復合體和目標位點，以加強與環狀RNA相關的結腸直腸癌的診斷和治療方案。伴隨著研究的深入以及環狀RNA研究技術的發展，環狀RNA有望成為結直腸癌早期診斷的分子標志物和基因治療的新途徑。