花生FAD2基因CRISPR/Cas9多靶點敲除載體構建

李柯　趙昆昆　寧龍龍　馬倩　李忠峰　馬興立　張幸果　殷冬梅

摘要：ω-6脂肪酸脫氫酶控制花生中油酸向亞油酸的轉化，該酶由AhFAD2基因編碼。為了研究AhFAD2基因的功能，本研究根據前期已經克隆得到的AhFAD2基因序列，設計了gRNA前導序列，并構建了CRISPR/Cas9基因編輯載體，通過雙酶切和Sanger測序確定載體構建成功。AhFAD2基因CRISPR/Cas9載體的構建為接下來的遺傳轉化及研究該基因的功能奠定了基礎。

關鍵詞：花生;FAD2;CRISPR/Cas9;基因敲除

中圖分類號：S565.2：Q782文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）09-0056-08

Construction of CRISPR/Cas9 Multi-Target

Knockout Vector of FAD2 Gene in Peanut

Li Ke， Zhao Kunkun， Ning Longlong， Ma Qian， Li Zhongfeng， Ma Xingli， Zhang Xingguo， Yin Dongmei

（College of Agronomy， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China）

Abstract The omega-6 fatty acid dehydrogenase controls the conversion of oleic acid into linoleic acid in peanut， which is encoded by the AhFAD2 gene. In order to research the function of AhFAD2 gene， the gRNA leader sequence was designed based on the sequence of AhFAD2 gene cloned in previous stage， and the CRISPR/Cas9 gene editing vector was constructed in this study. The vector was successfully constructed after determined by double enzyme digestion and Sanger sequencing. The construction of AhFAD2 gene CRISPR/Cas9 vector laid foundations for the subsequent genetic transformation and function study of the gene.

Keywords Peanut; FAD2; CRISPR/Cas9; Gene knockout

基因編輯技術是利用DNA斷裂及其修復機制[1]，使其產生堿基的突變、DNA片段的缺失和插入等現象，達到使基因不能正常行使功能或改變其功能的目的。DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks， DSBs）的現象在分裂活躍的哺乳動物細胞中每天都會發生[2-5]，但這種自發斷裂難以利用。因此，基因組定點編輯技術對基因功能的研究、分子育種和遺傳改良帶來了巨大的便利。鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）[6]和類轉錄激活因子效應物核酸酶（transcription activator-likeeffector nucleases，TALENs）[7]技術是前期應用的兩種基因組編輯技術，ZFNs和TALENs都是由識別蛋白和核酸內切酶兩部分組成，識別蛋白引領核酸內切酶到識別靶位點，然后核酸內切酶在該位點對DNA進行切割產生DSBs，使其在隨后的修復過程中產生基因序列的變化[8，9]。但這兩種技術操作復雜，成本高昂，限制了其發展。

CRISPR/Cas9系統是第三代基因組編輯技術，來源于古細菌和細菌，Makarova等[10]將該系統分為三種類型：TypeⅠ，TypeⅡ，TypeⅢ。Jinek等[11]發現TypeⅡ的CRISPR/Cas9效應復合物結構簡單，該系統中的Cas9蛋白是一種核酸酶，該酶與crRNA和tracrRNA結合就能對DNA進行切割，并且闡明了靶向DNA特定位點的原則。2013年，Cong等[12]直接利用短的特異性RNA引導Cas9核酸酶到人和小鼠的基因特定位點對DNA進行切割。當今在各種研究中應用最多的就是TypeⅡ類CRISPR/Cas9系統。該系統自2013年誕生以來，由于操作簡便、價格低廉、準確度高而被廣泛運用，成為基因組定點編輯的首選方法[13]。目前，CRISPR/Cas9系統已在擬南芥[14]、煙草[15]、水稻[16]、小麥[17]等植物中應用。

花生是重要的油料作物，種子的含油量在50%左右[18]。花生油中的脂肪酸主要由油酸和亞油酸組成，二者都為不飽和脂肪酸，含量占總脂肪酸的80%左右，且二者呈負相關[19]。因為油酸含有一個雙鍵，亞油酸含有兩個雙鍵，因此油酸的化學性質更加穩定。油酸含量高的花生及其制品能夠擁有更長的貨架期[20]。AhFAD2基因編碼ω-6脂肪酸脫氫酶，該酶控制油酸向亞油酸的轉化。Abe等[21]通過CRISPR/Cas9介導的靶向突變破壞了OsFAD2-1基因，獲得的水稻后代油酸含量為野生型的二倍。Wang等[22]發現AhFAD2基因家族有六個成員，其中AhFAD2-2為前人研究報道最多的一個成員，AhFAD2-1為新發現在種子中高度表達的一個成員。到目前為止，CRISPR/Cas9技術在花生基因功能研究中的應用鮮見報道。因此，本研究利用可以同時連接六個靶位點引物的CRISPR/Cas9載體，構建花生AhFAD2-1和AhFAD2-2基因多靶點CRISPR/Cas9載體，為接下來的遺傳轉化打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種與質粒 [HT]大腸桿菌感受態細胞DH5α和根癌農桿菌感受態細胞LBA4404購自鄭州寶賽生物技術有限公司。sgRNA表達盒載體psgR-AtU6-26、psgR-AtU3b、psgR-At7SL和表達Cas9蛋白的植物遺傳轉化載體pEX-Cas9-At由中國科學院上海植物逆境生物學研究中心朱健康實驗室饋贈。

1.1.2 主要試劑 [HT]BbsⅠ、HindⅢ、XhoⅠ、XbaⅠ、XmaⅠ限制性內切酶購自New England Biolabs公司，T4 Ligase、堿性磷酸酶（alkaline? phosphatase）、KpnⅠ和EcoRⅠ限制性內切酶購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 靶位點序列的設計與引物合成 靶位點序列設計利用華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室和生物信息學中心開發的CRISPR-P 2.0（http：//crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）在線軟件設計。每個基因設計三個靶位點引物，根據對應的sgRNA表達盒載體上的酶切位點，在引物上添加酶切識別序列。本試驗所用引物由北京六合華大基因公司合成，引物序列見表1。

1.2.2 sgRNA表達盒的構建

將質粒psgR-AtU6-26、psgR-AtU3b、psgR-At7SL和pEX-Cas9-At轉化大腸桿菌DH5α，分別培養在含氨芐青霉素（50 μg/mL）和卡那青霉素（50 μg/mL）的固體LB培養基上，待長出菌落后，挑選單克隆擴大培養，提取質粒。載體構建流程見圖1。

將靶位點引物用ddH2O溶解為100 μmol/L的母液，取各個靶位點的正向和反向引物各1 μL，再加入1μL的10×T4 Ligation Buffer，用ddH2O將體系補充到10 μL。將配好的體系放置于PCR儀中，設置程序為95℃ 5 min，然后以0.1℃/s的降溫速度將溫度降至25℃，完成靶位點引物的退火。

用BbsⅠ限制性內切酶對sgRNA表達盒載體psgR-AtU6-26、psgR-AtU3b、psgR-At7SL分別進行單酶切：各加入總量為1 μg的sgRNA表達盒載體psgR-AtU6-26、psgR-AtU3b、psgR-At7SL，1 μL BbsⅠ限制性內切酶，

3 μL的10×Cutsmart Buffer，用ddH2O將體系補充到30 μL，置于37℃反應2 h。用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，切下酶切完全的目的條帶，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收，回收產物置于-20℃下，用于后續試驗。

退火后的靶位點引物與酶切后的sgRNA表達盒載體psgR-AtU6-26、psgR-AtU3b、psgR-At7SL進行連接：將退火后的靶位點引物稀釋200倍到濃度為0.05 μmol/L，其中FAD2-1g1和FAD2-2g1分別與psgR-AtU6-26進行連接，FAD2-1g2和FAD2-2g2分別與psgR-AtU3b進行連接，FAD2-1g3和FAD2-2g3分別與psgR-At7SL進行連接，各反應體系加入1 μL稀釋后的靶位點引物，分別加入總量為10 ng的各自相對應的sgRNA表達盒載體單酶切產物，1 μL的10×T4 Ligation Buffer，0.5 μL的T4 Ligase， 用ddH2O將體系補充到10 μL，置于16℃反應2 h。反應完后應用熱激法轉化大腸桿菌感受態DH5α，涂布于含100 mg/L Amp的LB固體培養基上，倒置狀態下37℃培養過夜。挑選單克隆，接種于含100 mg/L Amp的LB液體培養基中，在37℃、200 r/min的條件下振蕩培養過夜。取菌液進行PCR檢測，目標片段長度為360 bp，反應體系為：1 μL菌液，1 μL M13F（10 μmol/L），1 μL各靶位點的反向引物（10 μmol/L），10 μL 2×Taq PCR MasterMix，補充ddH2O至20 μL。擴增程序：95℃預變性5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，進行30個循環;最后72℃延伸5 min。每一個連接體系挑選一個陽性克隆，提取質粒。

雙酶切上一步獲取的質粒，得到sgRNA表達盒。雙酶切體系如下：各反應體系加入總量為2 μg的質粒，連接靶位點的psgR-AtU6-26質粒雙酶切體系中加入1 μL HindⅢ和1 μL XhoⅠ，連接靶位點的psgR-AtU3b質粒雙酶切體系中加入1 μL XhoⅠ和1 μL XbaⅠ，連接靶位點的psgR-At7SL質粒雙酶切體系中加入1 μL XbaⅠ和1μL XmaⅠ，5 μL 10× Cutsmart Buffer，補充ddH2O至50 μL。體系置于37℃反應2 h。用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，電泳后，psgR-AtU6-26質粒雙酶切體系切下約470 bp的片段，psgR-AtU3b質粒雙酶切體系切下約480 bp的片段，psgR-At7SL質粒雙酶切體系切下約530 bp的片段，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收，回收產物即為sgRNA表達盒。

1.2.3 FAD2-1和FAD2-2的三個sgRNA表達盒片段與pEX-Cas9-At載體的連接 pEX-Cas9-At質粒的雙酶切：加入總量為2 μg的質粒，1 μL HindⅢ，1 μL XmaⅠ，5 μL 10× Cutsmart Buffer，補充ddH2O至50 μL。體系置于37℃反應2 h，然后加入

1 μL堿性磷酸酶，37℃反應1 h。利用苯酚-氯仿萃取法純化雙酶切后的產物，回收產物溶解在30 μL ddH2O中，-20℃保存。

由于每個基因的三個sgRNA表達盒酶切接頭前后相連，因此在pEX-Cas9-At質粒的雙酶切位點處可依次連上這三個sgRNA表達盒，連接體系為：在每個基因的連接體系中加入各為35 ng的三個sgRNA表達盒，95 ng pEX-Cas9-At質粒的雙酶切回收產物，2 μL的10× T4 Ligation Buffer，1 μL T4 Ligase， 用ddH2O將體系補充到20 μL。體系置于16℃反應2 h。反應完后應用熱激法轉化大腸桿菌感受態DH5α，涂布于含50 mg/L Kan的LB固體培養基上，倒置狀態下37℃培養過夜。挑選單克隆，接種于含50 mg/L Kan的LB液體培養基中，在37℃、200 r/min的條件下振蕩培養過夜。取菌液進行PCR檢測，目標片段長度為1 400 bp，反應體系為：1 μL菌液，1 μL M13F（10 μmol/L），1 μL連接于psgR-At7SL上的靶位點反向引物（10 μmol/L），10 μL 2×Taq PCR MasterMix，補充ddH2O至20 μL。擴增程序：95℃預變性5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1.5 min，進行30個循環;最后72℃延伸5 min。每一個連接后轉化挑選一個陽性克隆，提取質粒。

1.2.4 第二個sgRNA表達盒串聯片段與pEX-Cas9-At載體的連接 用AtU6-F-KpnⅠ和sgR-R-EcoRⅠ引物對分別擴增上一步獲得的連接有FAD2-1和FAD2-2三個sgRNA表達盒串聯片段的pEX-Cas9-At載體，體系為：質粒200 ng，2 μL AtU6-F-KpnⅠ（10 μmol/L），2 μL sgR-R-EcoRⅠ（10 μmol/L），2×Pfu PCR MasterMix 25 μL，補充ddH2O至50 μL。擴增程序：95℃預變性5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1.5 min，進行30個循環;最后72℃延伸5 min。擴增完畢后，用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，電泳后，切下約1 400 bp處的片段凝膠，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收，回收產物即為第二個sgRNA表達盒串聯片段，置于-20℃下，用于后續試驗。

用KpnⅠ和EcoRⅠ限制性內切酶對上一步獲得的回收產物和連接有FAD2-1和FAD2-2三個sgRNA表達盒串聯片段的pEX-Cas9-At載體進行雙酶切。反應體系為：0.5 μg第二個sgRNA表達盒串聯片段/1 μg連接有FAD2-1或FAD2-2三個sgRNA表達盒串聯片段的pEX-Cas9-At載體，1 μL KpnⅠ限制性內切酶，1 μL EcoRⅠ限制性內切酶，5 μL 10×Cutsmart Buffer，補充ddH2O至

50 μL。體系置于37℃反應2 h，然后加入1 μL堿性磷酸酶，37℃反應1 h。第二個sgRNA表達盒串聯片段酶切后的純化回收利用DNA純化回收試劑盒進行，連接有FAD2-1和FAD2-2三個sgRNA表達盒串聯片段的pEX-Cas9-At載體酶切后的純化回收利用苯酚-氯仿萃取法，回收產物溶解在30 μL ddH2O中，-20℃保存。

將上一步酶切后回收的FAD2-1的sgRNA表達盒串聯片段與上一步酶切后回收的連接有FAD2-2三個sgRNA表達盒串聯片段的pEX-Cas9-At載體進行連接，連接體系為：95 ng FAD2-1的sgRNA表達盒串聯片段，95 ng連接有FAD2-2三個sgRNA表達盒串聯片段的pEX-Cas9-At載體，2 μL 10× T4 Ligation Buffer，1 μL T4 Ligase， 用ddH2O將體系補充到20 μL。體系置于16℃反應2 h。反應完后應用熱激法轉化大腸桿菌感受態DH5α，涂布于含50 mg/L Kan的LB固體培養基上，倒置狀態下37℃培養過夜。挑選單克隆，接種于含50 mg/L Kan的LB液體培養基中，在37℃、200 r/min的條件下振蕩培養過夜。取菌液進行PCR檢測，目標片段長度為1 200 bp，反應體系為：1 μL菌液，1 μL M13R（10 μmol/L），1 μL連接于psgR-AtU6-26上的靶位點正向引物（10 μmol/L），10 μL 2×Taq PCR MasterMix，補充ddH2O至20 μL。擴增程序：95℃預變性5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1.5 min，進行30個循環;最后72℃延伸5 min。挑選一個陽性克隆，提取質粒。

酶切后回收的FAD2-2的sgRNA表達盒串聯片段與上一步酶切后回收的連接有FAD2-1三個sgRNA表達盒串聯片段的pEX-Cas9-At載體的連接同上。

2 結果與分析

2.1 sgRNA表達盒的構建

用BbsⅠ限制性內切酶對sgRNA表達盒載體psgR-AtU6-26、psgR-AtU3b、psgR-At7SL分別進行單酶切，酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切下約為3 100 bp的片段，純化回收。退火后的靶位點引物與BbsⅠ限制性內切酶單酶切后的sgRNA表達盒載體進行連接，轉化大腸桿菌，挑選單克隆，利用PCR進行鑒定，陽性克隆條帶長約360 bp（圖2）。各挑選一個陽性克隆擴大繁殖后提取質粒，進行雙酶切，連接靶位點的psgR-AtU6-26質粒用HindⅢ和XhoⅠ雙酶切，連接靶位點的psgR-AtU3b質粒用XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切，連接靶位點的psgR-At7SL質粒用XbaⅠ和XmaⅠ雙酶切，酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切下約為500 bp的片段（圖3），符合預期為470、480、530 bp的片段大小，回收產物即為sgRNA表達盒。

2.2 sgRNA表達盒與pEX-Cas9-At載體的連接

用Hind Ⅲ和XmaⅠ雙酶切pEX-Cas9-At載體，酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切下約為14 000 bp的片段（圖4A），純化回收。sgRNA表達盒與pEX-Cas9-At載體連接后轉化大腸桿菌，挑選單克隆，利用PCR進行鑒定，陽性克隆條帶長約為1 400 bp（圖4B）。各挑選一個陽性克隆擴大繁殖后提取質粒。

2.3 第二個sgRNA表達盒串聯片段與pEX-Cas9-At載體的連接

用AtU6-F-Kpn Ⅰ和sgR-R-EcoR Ⅰ引物對擴增已經連接上sgRNA表達盒的pEX-Cas9-At載體，獲得第二個sgRNA表達盒串聯片段，擴增產物長約1 400 bp（圖5A），電泳后切下目標片段，純化回收。

pEX-Cas9-At載體的第二個連接位點需用KpnⅠ和EcoRⅠ限制酶進行切割，且上一步獲得純化產物帶有KpnⅠ和EcoRⅠ限制酶切位點，因此對載體和純化回收產物雙酶切后進行連接反應。連接后轉化大腸桿菌，挑選單克隆，利用PCR進行鑒定，陽性克隆條帶長約為1 200 bp（圖5B）。對獲得的陽性克隆進行測序鑒定，驗證目的序列是否正確插入，結果證明序列正確插入（圖6），載體構建成功。

3 討論與結論

CRISPR/Cas9是一種簡單、高效的基因編輯系統，針對不同的基因，每次只需要設計一個或多個該基因的特異sgRNA即可，相比鋅指核酸酶（ZFNs）和類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALENs）技術，CRISPR/Cas9節約了大量的時間、人力和物力，大大推動了基因基礎研究的發展。

本研究構建的CRISPR/Cas9載體同時包含FAD2-1基因的三個靶位點和FAD2-2基因的三個靶位點，且兩個sgRNA表達盒串聯片段所處位置不同。在單個載體中攜帶多個基因和多個靶位點，不僅能夠大大減少載體構建的時間，還能夠增加CRISPR/Cas9系統的編輯效率，可以同時敲除多個基因。Ma[23]同時靶向一個基因家族的多個（多達8個）成員，并且自T0代水稻和T1代擬南芥中得到了多個位點突變的個體。趙恒等[24]構建了靶向BnSVP的 CRISPR /Cas9 基因組編輯載體，應用雙靶點策略，對4個或2個同源基因進行同時敲除。這與本試驗的載體構建思路類似，在接下來的遺傳轉化試驗中，我們期望可以得到多個基因位點同時突變的個體。

啟動子對CRISPR/Cas9系統行使功能十分重要，應用合適的啟動子，CRISPR/Cas9系統才能在轉化受體內發揮作用。本試驗構建的載體使用的是pAtU6-26、pAtU3b、pAt7SL和pAtUBQ，主要用于擬南芥CRISPR/Cas9系統。目前，還沒有針對花生CRISPR/Cas9系統專門設計啟動子，因此，我們首先會嘗試使用這些啟動子，在接下來的遺傳轉化試驗中驗證其在花生中是否具有啟動轉錄功能，也可以利用花生自身的啟動子驅動sgRNA和Cas9蛋白的表達。石磊等[25]獲得的AhSAD基因的啟動子為組成型表達，在以后的試驗中可以將其應用于花生的CRISPR/Cas9系統。此外，還可以對CRISPR/Cas9系統中Cas9蛋白的編碼基因進行優化，使其在花生中能夠更好地翻譯表達，建立適合花生的CRISPR/Cas9基因組編輯體系，推動花生的基因功能研究、分子育種等工作的快速發展。

本研究通過將花生FAD2-1和FAD2-2基因的gRNA與sgRNA骨架連接，雙酶切獲得sgRNA表達盒，然后分別將兩個基因的sgRNA表達盒串聯連接到pEX-Cas9-At載體，獲得含有單個基因sgRNA表達盒串聯片段的重組載體，而后通過利用含有酶切位點的引物進行PCR，獲得sgRNA表達盒串聯片段，分別與已含有另一個sgRNA表達盒串聯片段的重組載體再次連接，獲得同時針對兩個基因且sgRNA表達盒串聯片段所處位置不同的重組載體。成功構建了針對花生FAD2-1和FAD2-2的多靶點CRISPR/Cas9基因編輯載體。

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收稿日期：2019-07-24

基金項目：國家自然科學基金項目（U1704232）;河南省產業技術體系項目（S2012-05-G03）

作者簡介：李柯（1995—），男，河南南陽人，碩士研究生。

通訊作者：殷冬梅（1972—），女，河南南陽人，博士，教授，主要從事花生遺傳育種工作。E-mail：yindm@126.com