搜山虎水提液對小鼠抗疲勞、耐缺氧作用的實驗研究

劉雪婷 韋秋菊 周小蘇 楊鳳雯 羅彩鳳 黃永毅

【摘要】?目的?研究搜山虎水提液對小鼠抗疲勞及耐缺氧作用的影響。

方法?將小鼠隨機分成四組，即正常對照組和搜山虎水提液低劑量10 g/kg、中劑量20 g/kg、高劑量40 g/kg三個劑量組，連續灌胃7天后，采用小鼠負重游泳力竭實驗來評價抗疲勞功能，通過小鼠常壓耐缺氧實驗、小鼠急性腦缺血缺氧實驗來評價其耐缺氧功能，測定小鼠血清的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性及丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）含量，探討其發生機制，并且檢測藥液對小鼠肝臟是否有影響。

結果?搜山虎水提液低、中、高劑量組的小鼠負重游泳力竭時間均長于正常對照組 （P<0.05或0.01），而低、中、高三個劑量組兩兩比較差異無統計學意義（P>0.05）。搜山虎中、高劑量組小鼠血清中的SOD活力高于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;搜山虎中、高劑量組小鼠血清中的MDA含量均低于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.05或0.01）;搜山虎中、高劑量組的小鼠在常壓條件下耐缺氧存活時間均長于正常對照組（P<0.01）;搜山虎中、高劑量組小鼠斷頭后張口次數多于正常對照組，喘息維持時間均長于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.05或0.01）;四組小鼠肝臟指數比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

結論?搜山虎水提液具有抗疲勞、耐缺氧作用，對小鼠肝臟無明顯影響。

【關鍵詞】?搜山虎;抗疲勞;耐缺氧;小鼠

中圖分類號：R977.2;R589.1?文獻標志碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.10.005

Experimental study on the effect of water extract ofZanthoxylum austrosinenseHuang on fatigue resistance and hypoxia tolerance in mice

LIU Xueting1，WEI Qiuju1，ZHOU Xiaosu1，YANG Fengwen1，LUO Caifeng1，HUANG Yongyi2

（1.Class 2，Grade 2015 of Pharmaceutical Undergraduate，2.Functional Experimental Teaching Center，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China）

【Abstract】?Objective?To study the effect of the water extract of Zanthoxylum austrosinense Huang on fatigue resistance and hypoxia tolerance in mice.

Methods?Mice were randomly divided into the following four groups：normal control group and three dose groups of water extract of Zanthoxylum austrosinense Huang—low dose group（10 g/kg），medium dose group（20 g/kg） and high dose group（40 g/kg）.After 7 days of continuous intragastric administration，fatigue resistance function in mice was evaluated by weight-bearing swimming exhaustion test，and hypoxia tolerance function in mice was evaluated by hypoxia tolerance test under ordinary pressure and acute cerebral ischemia and anoxia test.The activity of superoxide dismutase（SOD） in serum and the content of maleic dialdehyde（MDA） in serum of mice were measured to explore its mechanism.In addition，the effect of liquid medicine on the liver of mice was also detected.

Results?The exhaustion time of weight-bearing swimming of the low dose group，the medium dose group and the high dose group was longer than that of the control group（P<0.05 or 0.01），while the differences of pairwise comparisonbetween thelow dose group，the medium dose group and the high dose group were not statistically significant（P>0.05）.The activity of SOD in serum of mice in the medium dose group and the high dose group was higher than that of normal control group，difference was statistically significant（P<0.05）;the content of MDA in serum of mice in the medium dose group and high dose group was less than that of normal control group，the difference was statistically significant（P<0.05 or 0.01）.Survival time of hypoxia tolerance in mice under ordinary pressure of the medium dose group and high dose group was longer than that of the normal control group（P<0.01）.Compared with the control group，the medium dose group and the high dose group had more times of mouth opening and longer duration of wheezing，the difference was statistically significant（P<0.05 or 0.01）.There was no statistically significant difference in liver indexes among the four groups（P>0.05）.

Conclusion?The water extract of Zanthoxylum austrosinense Huang has the function of fatigue resistance and hypoxia tolerance，but has no obvious effect on the liver of mice.

【Key words】?Zanthoxylum austrosinense Huang;fatigue resistance;hypoxia tolerance;mouse

搜山虎（Zanthoxylum austrosinense Huang）是蕓香科植物花椒屬的根，主要產于浙江、江西、湖南、廣東、廣西，其成分有阿托品堿、天仙子堿。在《中華本草》中也有關于搜山虎的相關記載，當代多用于祛風解表，行氣活血，消腫止痛，主要適用于感冒風寒，風濕痹痛，跌打腫痛等。在《素問·宣明五氣》中提到“久視傷血，久臥傷氣，久行傷筋，久立傷骨”，說明過度疲勞會損害人的氣血，傷及筋骨，疲勞是屬于氣血耗損而引起的虛癥[1]。研究顯示[2]，活血行氣藥佛手能夠明顯延長小鼠的負重游泳力竭的時間，表明其可增強小鼠抗運動性疲勞的能力。具有舒筋活絡、活血祛瘀功效的紅花牡丹膏方可明顯減少小鼠從棒上跌落的次數，有很好的抗疲勞功效[3]。因此我們推測具有活血行氣的藥物可能具有抗疲勞的功效。本課題組通過對小鼠負重游泳力竭實驗、小鼠常壓耐缺氧實驗以及小鼠急性腦缺血缺氧實驗，檢測小鼠負重游泳力竭后血清中超氧化物歧化酶（super oxid dismutase，SOD）活性和丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）含量及測定小鼠肝臟指數來對搜山虎作用進行初步探討，旨在為其進一步開發利用提供實驗依據。

1?材料與方法

1.1?試劑

SOD試劑盒（批號：20180104）和MDA測試盒（批號：20180103）購于南京建成生物工程研究所;白凡士林（批號：180101，南昌華鑫醫藥化工有限公司）;鈉石灰（批號：180429，西隴化工股份有限公司）。

1.2?儀器

游泳箱（長60 cm，寬60 cm，深40 cm）;鉛條，手術器械，250 mL廣口玻璃瓶，722N型可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司），電子天平（型號：JM-B1003，余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司）;電熱恒溫水溫箱（型號：H.SWX-600BS，上海新苗醫療器械制造有限公司）;離心機（型號：TGL-16G，上海安亭科學儀器廠）。

1.3?動物

清潔級昆明種小鼠120只，雌雄各半，體重18～22 g，由右江民族醫學院實驗動物中心提供，許可證號為：SYXK桂2017-0004。

1.4?藥品

中藥搜山虎采購于廣西百色市市區回春藥店，經右江民族醫學院民族醫藥教研室覃道光副教授鑒定為蕓香科植物花椒屬的干燥根莖。

1.5?實驗方法

1.5.1?搜山虎水提物的制備[4]

將搜山虎粉碎，稱取250 g藥材，加入10倍體積的蒸餾水浸泡1 h，武火煮沸后文火煎煮0.5 h，用紗布過濾得到第一次濾液，再加入適量的蒸餾水進行煎煮0.5 h后，過濾得到第二次濾液，合并兩次濾液，濃縮至100 mL。最后將濃縮好的藥液放入冰箱中保存，用時恢復至室溫，用原液2.5 g/mL分別用蒸餾水稀釋至2.0 g/mL和1.0 g/mL。

1.5.2?動物分組及處理

120只小鼠，雌雄各半，隨機分為3批，每批40只。第一批，取40只小鼠，按體重隨機分成正常對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只，用于小鼠負重游泳力竭實驗和小鼠游泳力竭后血清中SOD活力以及MDA含量的測定。第二批，取40只小鼠，按體重隨機分成正常對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只，用于小鼠常壓耐缺氧實驗。第三批，取40只小鼠，按體重隨機分成正常對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只，用于小鼠急性腦缺血缺氧實驗和小鼠肝臟指數的測定。每批實驗小鼠均分為正常對照組和搜山虎水提液低、中、高（10 g/kg、20 g/kg、40 g/kg）三個劑量組，采用小鼠灌胃法，正常對照組按體重給0.1 mL/10 g蒸餾水灌胃;低、中、高劑量組分別給予小鼠不同劑量的受試物，并按給藥容積0.1 mL/10 g，1次/d，連續灌胃給藥7 d，然后進行實驗。

1.5.3?小鼠負重游泳力竭實驗[5]

各組小鼠連續灌胃7 d后，于末次給藥前進行稱重后再灌胃給藥，給藥1 h后，給小鼠尾部系其體重5%的鉛絲，然后放在游泳箱中游泳（游泳箱水深大約放到30 cm，水溫調為25℃），每個游泳池箱只放入10只小鼠，以小鼠頭部全部進入水中并持續8 s沒有浮出水面作為判定終點，該時間則記為小鼠負重游泳力竭時間。

1.5.4?小鼠力竭后血清SOD活力、MDA含量的測定

從負重游泳力竭實驗的小鼠游泳結束后，休息0.5 h，摘取小鼠眼球，取血，進行離心，靜置后抽取血清，并按試劑盒說明書進行操作，測定力竭后小鼠血清中的SOD活力和MDA含量。

1.5.5?小鼠常壓耐缺氧實驗[6]

各組小鼠連續灌胃7 d后，于末次給藥前進行稱重后再灌胃給藥，給藥1 h后，將小鼠分別放入盛有10 g鈉石灰的250 mL的廣口玻璃瓶內，采用白凡士林將瓶口涂抹并蓋嚴，保證玻璃瓶密封性良好，蓋上瓶蓋立即計時，以呼吸停止（小鼠掙扎抽搐后突然癱瘓，胸部沒有任何波動）為觀察截點，記錄小鼠在密閉廣口玻璃瓶內的存活時間，該時間記為小鼠常壓耐缺氧的存活時間。

1.5.6?小鼠急性腦缺血缺氧實驗[7～8]

各組小鼠連續灌胃7 d，于末次灌胃前稱重后再灌胃給藥，給藥1 h后，手抓穩老鼠，迅速從小鼠耳后2 mm逐只斷頸，立即計時，觀察并記錄小鼠張口喘息的次數和喘息維持的時間。

1.5.7?測定小鼠肝臟指數[9]

于小鼠急性腦缺血缺氧實驗結束后，立即解剖小鼠，取出小鼠肝臟，稱取每只小鼠肝臟重量，并仔細記錄下來。肝臟指數=肝濕重（g）/體重（g）×100%。

1.6?統計學方法

采用SPSS 24.0軟件對數據進行處理，計量資料服從正態分布，以均數±標準差（±s）表示，多組之間的比較，采用單因素方差分析，組間進一步兩兩比較采用LSD檢驗，檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2?結果

2.1?搜山虎水提液對小鼠負重游泳力竭時間的影響

四組小鼠負重游泳力竭時間比較，差異有統計學意義（P<0.01），其中搜山虎水提液低、中、高劑量組的小鼠負重游泳力竭時間均高于正常對照組 （P<0.05或0.01），而低、中、高三個劑量組兩兩比較差異無統計學意義（P>0.05）。提示搜山虎水提液能夠延長小鼠負重游泳力竭時間，但無量效相關性。見表1。

2.2?搜山虎水提液對游泳力竭小鼠血清SOD和MDA的影響

四組小鼠游泳力竭小鼠血清SOD活力和MDA含量比較，差異均有統計學意義（P<0.05或0.01）。其中搜山虎中、高劑量組小鼠血清中的SOD活力高于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;搜山虎低劑量組的SOD活力也高于正常對照組，但差異無統計學意義（P>0.05）;搜山虎中、高劑量組小鼠血清中的MDA含量均低于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.05或0.01）;搜山虎低劑量組的MDA含量也低于正常對照組，但差異無統計學意義（P>0.05）。提示中、高劑量的搜山虎水提液能明顯提高負重游泳力竭后小鼠血清中的SOD活力，降低小鼠血清中MDA含量。見表2。

2.3?搜山虎水提液對小鼠常壓耐缺氧能力的影響

四組小鼠常壓耐缺氧能力比較，差異有統計學意義（P<0.01），其中搜山虎中、高劑量組的小鼠在常壓條件下耐缺氧存活時間均長于正常對照組（P<0.01）;搜山虎低劑量組存活時間也長于正常對照組，但差異無統計學意義（P>0.05）。提示中、高劑量搜山虎水提液能明顯延長小鼠常壓耐缺氧的存活時間。見表3。

2.4?搜山虎水提液對小鼠斷頭喘息的影響

四組小鼠斷頭后喘息次數及喘息維持時間比較，差異均有統計學意義（P<0.05或0.01）。其中搜山虎中、高劑量組小鼠斷頭后張口次數多于正常對照組，喘息維持時間長于正常對照組（P<0.05或0.01）;搜山虎低劑量組小鼠的張口次數多于正常對照組，喘息時間也長于正常對照組，但差異無統計學意義（P>0.05）。提示中、高劑量搜山虎水提液能明顯增加小鼠斷頭后的張口喘息次數，并且能延長小鼠斷頭后的喘息維持時間，有耐缺氧作用。見表4。

2.5?搜山虎水提液對小鼠肝臟指數的影響

四組小鼠肝臟指數比較，差異無統計學意義（P>0.05）。提示試藥劑量對小鼠肝臟無明顯影響。見表5。

3?討論

疲勞是一種普遍生理現象和心理現象，是指腦力和體力到達一定程度后出現人體功能暫時性下降的現象。運動耐力的提高是機體抗疲勞能力加強的最直接表現，檢測機體的生化指標和耐力實驗是目前評價疲勞的常用方法[10]。

SOD屬于重要的抗氧化酶，是存在于機體內的清除氧自由基因子，在減少氧自由基對機體造成損傷及抗疲勞等方面發揮著很重要的作用。其活力水平可反映機體清除自由基、抗氧化的能力。MDA是氧自由基脂質過氧化分解產物，促使蛋白質變性，具有細胞毒性，其含量可反映機體內抗氧化能力和清除氧化產物的能力[11～12]。唐華偉等[13]研究報道，機體運動產生疲勞的重大原因是自由基及活性氧的增加，導致機體受到損害。

本實驗中，測定小鼠負重游泳力竭時間，并檢測負重游泳力竭小鼠血清中SOD活力和MDA含量。結果顯示，搜山虎中、高劑量組小鼠可明顯延長小鼠的負重游泳力竭時間，說明搜山虎水提液可以提高小鼠的運動耐力，具有抗疲勞作用。在小鼠游泳力竭后檢測其血清SOD活力及MDA含量，結果顯示，小鼠血清SOD活性增加，這說明搜山虎有助于減少自由基和提高抗氧化能力，減輕有害物質對小鼠機體的侵害;小鼠血清MDA含量降低，表明搜山虎有助于提高清除機體運動后產生自由基的能力，達到抗疲勞效果。

缺氧是機體所產生的一種緊張性刺激，在現實生活中經常會出現缺氧的現象，運動對機體耗氧量增加，體內相對供氧不足就會造成缺氧，輕度缺氧會影響機體新陳代謝，重度缺氧會使心腦受損，甚至會因氧供應不足而死亡[14]，因此，研究缺氧是有重要意義的。評價缺氧能力常用的實驗模型是小鼠常壓耐缺氧模型[15]。在本次常壓耐缺氧實驗中，搜山虎水提液中、高劑量組小鼠耐缺氧時間明顯延長，說明搜山虎具有抗常壓缺氧的作用;在小鼠急性腦缺血缺氧實驗中，搜山虎水提液中、高劑量組小鼠斷頭后張口次數多于正常對照組，喘息維持時間長于正常對照組，說明中、高劑量搜山虎水提液能增加小鼠斷頭后的張口喘息次數，并且能延長小鼠斷頭后的喘息維持時間。實驗結果表明搜山虎具有抗常壓缺氧的作用;同時在檢測其肝臟指數結果顯示，搜山虎在本實驗劑量下對小鼠肝臟無明顯影響。

綜上，搜山虎具有抗疲勞及耐缺氧作用，其發生機制可能與提高機體血清中SOD活力和降低MDA含量有關。是否還有其他的作用機制，有待于進一步研究。

參?考?文?獻

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（收稿日期：2019-08-06?修回日期：2019-09-16）