SSR和ISSR法對白芨的真?zhèn)舞b定①

邢佳鑫 陳 玲 張 希 張敦宇 李維蛟③

(1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院 云南昆明650201;2云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室/農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室云南昆明650205;3云南中醫(yī)藥大學(xué) 云南昆明650500)

白芨（Bletilla striata）是蘭科多年生草本地生植物，生長在海拔100～3 200 m的常綠闊葉林下，櫟樹林、路邊草或巖石縫中，是珍貴的藥用植物，具有收斂止血、清熱解毒、抗菌、抗腫瘤、消腫生肌的功能。白芨膠可作為天然高分子藥物成膜材料、助懸劑和天然的藥物乳化劑［1-4］。近年來，市場對白芨的需求量在不斷上升，但白芨種子在自然狀況下很難萌發(fā)和生長，因此白芨組培苗成為當前人工栽培的主要種苗來源［5］。由于近年來正品藥材短缺難以滿足市場需求，民間常用其他類似品種取而代之，代用品、習(xí)用品的隨意使用使得中藥材品種復(fù)雜混亂的情勢加劇。隨著白芨組織培養(yǎng)及育苗技術(shù)的發(fā)展，白芨的偽品也越來越多，因此白芨組培苗的真?zhèn)舞b定逐漸成為市場需求的重要技術(shù)。

蘇鈦等發(fā)現(xiàn)，滇產(chǎn)白芨、小白芨、黃花白芨在植物形態(tài)、藥材性狀、顯微特征方面都高度相似，在分類學(xué)上特征差異亦較小［6］；陳美君等［7］對白芨和黃花白芨的化學(xué)成分進行分析比較，發(fā)現(xiàn)白芨和黃花白芨所含化學(xué)成分也很相似，難以鑒別。因此利用感官評價、顯微鑒定和理化鑒定等中藥鑒定技術(shù)［8］難以鑒別出真正的白芨苗。近些年來，分子標記技術(shù)在藥用植物鑒別研究中已有廣泛應(yīng)用，具有特異性強、穩(wěn)定性高、快速、微量，不受生長發(fā)育階段、器官組織差異、環(huán)境條件影響等優(yōu)勢，它給現(xiàn)代藥用植物的鑒別研究注入了新的活力，開辟了新的道路，雖尚處于資料積累階段，但可預(yù)見其具有巨大的應(yīng)用潛力，可推動中藥材的現(xiàn)代化研究進程［9-10］。《中國藥典》2010年版已將蘄蛇和烏梢蛇的分子鑒定作為評價指標［11］。其中SSR和ISSR具有獨特的優(yōu)勢，具有操作簡單、多態(tài)性豐富、重復(fù)性強、實驗穩(wěn)定性好、模板用量少和試驗成本低等優(yōu)點，不僅可用于不同產(chǎn)地藥用植物資源的劃分，同樣也可用于物種的鑒定與劃分，為育種工作奠定基礎(chǔ)。Safaei等［12-14］利用ISSR分子標記對6個丹參種的39個植物樣本進行研究，結(jié)果表明該技術(shù)能應(yīng)用于形態(tài)學(xué)研究中的物種鑒定與劃分。

本研究通過選用SSR引物和ISSR引物，應(yīng)用分子標記技術(shù)對外觀較相似的白芨組培苗與正品紫花白芨組培苗樣品進行遺傳多樣性分析，成功構(gòu)建了利用SSR和ISSR分子標記技術(shù)快速鑒定白芨組培苗真?zhèn)蔚姆椒ā?/p>

1 材料與方法

1.1 材料

白芨樣品：1份正品紫花白芨組培苗，實驗室內(nèi)培育，編號為1號；7份外觀較相似的白芨組培苗，于市場上購買得到，分別編為2～8號。

1.2 方法

1.2.1 白芨DNA的提取

采用改進的CTAB法［15］提取白芨的基因組DNA，即取約0.1 g樣品葉片，放入2 mL EP管內(nèi)，再放入經(jīng)酒精消毒過的直徑為5 mm的小鋼珠，寫好編號，放在方形的EP管盒內(nèi)，向盒內(nèi)倒入液氮，速凍葉片，倒出液氮，蓋上盒蓋，上下快速震蕩，使小鋼珠充分研磨葉片；加入400 μL含有2%（V/V）β-疏基乙醇的CTAB緩沖液，溫和混勻；65℃溫浴30～60 min，每隔一段時間振動一次離心管，使其充分混勻，受熱均勻；用等體積（400 μL）的氯仿/異戊醇（24∶1）抽提勻漿液，顛倒數(shù)次使其充分混勻，于18℃10 000 r/min離心10 min，吸取上清液到另一無菌的1.5 mL EP管中，加入等體積-20℃預(yù)冷30 min的異丙醇，顛倒混勻，-20℃靜置1 h；1 h后，于4℃ 10 000 r/min離心10 min沉淀DNA；棄上清液，加入適量（1 mL）75%乙醇洗滌沉淀，10 000 r/min，4℃，離心5 min；棄洗滌液，加入適量（1 mL）75%乙醇再次洗滌沉淀，10 000 r/min，4℃，離心5 min；于4℃ 10 000 r/min離心5 min，棄上清液，待DNA干燥后，用1×TE溶解，并用RNA酶除去RNA。總DNA采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量，并用紫外分光光度計（Thermo Nano-Drop 2 000）檢測DNA濃度，然后稀釋至25 ng/μL用于SSR-PCR和ISSR-PCR反應(yīng)。

1.2.2 SSR-PCR擴增

PCR反應(yīng)體系共20 μL，其中DNA模板（25ng/μL）2 μL，2×Mix（天根生物科技）10 μL，正反引物（10 μmol/L）各1 μL，ddH2O 6μL。PCR反應(yīng)在PCR擴增儀（Biometro）上按以下程序運行，首先94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸7 min，4℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物以MakerDL 1 000為分子量標準，取7 μL PCR產(chǎn)物用含GenGreen核酸染料的4%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像儀（Platinum HD7）下觀察拍照。

1.2.3 ISSR-PCR擴增

PCR總反應(yīng)體系為20 μL，包括DNA模板（25ng/μL）2 μL，2×Mix（天根生物科技）10 μL，正反引物（10 μmol/L）各1 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)在PCR擴增儀（Biometro）上按以下程序運行，首先94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物以MakerDL1 000為分子量標準，取7 μL PCR產(chǎn)物用含GenGreen核酸染料的3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外分光透射儀（Platinum HD7）下觀察拍照。

1.2.4 引物合成

選用黎君等篩選出的20對白芨SSR引物（表1）［16］，和22對ISSR隨機引物（表2），由上海生工公司合成。用20對SSR引物分別擴增1號正品白芨DNA，篩選出多態(tài)性豐富、主帶明顯的引物。

表1 SSR引物信息

表2 ISSR引物信息

1.2.5 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

用MakerDL 1 000作為分子量的標準，根據(jù)各擴增片段的遷移距離和大小，將SSR和ISSR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果中穩(wěn)定出現(xiàn)的條帶的有或無分別進行賦值，在相同遷移位置，有帶記為1，無帶記為0，以“0，1”格式構(gòu)成SSR和ISSR帶型數(shù)據(jù)矩陣。利用Excel進行統(tǒng)計和整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA質(zhì)量檢測

1份正品紫花白芨和7份組培苗的基因組DNA，在1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖1。所提取的DNA整齊，電泳條帶清晰，未被蛋白質(zhì)污染，也無降解，基因組DNA純度較高。所提DNA的質(zhì)量能滿足后續(xù)PCR擴增反應(yīng)。用紫外分光光度計在260和280 nm處測量吸光度A，進行DNA純度、濃度計算。將所提DNA的濃度全部稀釋為25 ng/μL，用于后續(xù)PCR擴增反應(yīng)。

圖1 8份材料的DNA電泳圖

2.2 引物篩選

20對SSR引物擴增1號正品白芨DNA的電泳檢測結(jié)果見圖2。從中篩選出重復(fù)性好，多態(tài)性豐富，條帶清晰的14對SSR引物，分別為Bjssr01、Bjssr03、 Bjssr04、 Bjssr05、 Bjssr06、Bjssr09、 Bjssr11、 Bjssr13、 Bjssr14、Bjssr17、 Bjssr19、 Bjssr22、 Bjssr23、Bjssr24。

圖2 SSR引物篩選結(jié)果

2.3 樣品差異性分析

部分SSR引物和部分ISSR引物對供試樣品的擴增結(jié)果分別見圖3。14對SSR引物中，發(fā)現(xiàn)有7對檢測出部分供試樣品之間帶型存在差異（表3）。22對ISSR引物中，發(fā)現(xiàn)有21對檢測出部分供試樣品之間帶型存在差異（表4）。其中，Bjssr03、Bjssr17和uBC808檢測出4號和8號樣品與1號標準品之間存在帶型差異；Bjssr05、Bjssr011檢測出4、5、6號和7號樣品與1號標準品之間存在帶型差異。Bjssr04、Bjssr14、Bjssr22、uBC811、uBC814、uBC815、uBC817、uBC818、uBC820和uBC823檢測出4、5、6、7號和8號樣品與1號標準品之間存在帶型差異。

綜上所述，篩選出的36對引物都未檢測出2號和3號與1號標準品之間存在帶型差異。根據(jù)不同的引物擴增結(jié)果，4、5、6、7號和8號樣品與1號標準品之間存在帶型差異。表明2號和3號為真的紫花白芨可能性較大，4、5、6、7號和8號為假的紫花白芨。

3 討論

本研究采用了分子標記技術(shù)，從基因?qū)用鎭龛b定白芨組培苗的真實性，解決了白芨真?zhèn)舞b定困難的問題，建立了更加精準，快捷的白芨鑒定的技術(shù)方法。共篩選出14對SSR引物和22對ISSR引物，其擴增結(jié)果多態(tài)性位點豐富，條帶清晰可見，結(jié)果穩(wěn)定，這些標記可作為白芨分子鑒定的依據(jù)。

近年來，SSR技術(shù)已成功應(yīng)用于作物品種的真?zhèn)舞b定方面，ISSR分子標記技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于道地藥材的品質(zhì)鑒定。楊雙等［17］應(yīng)用SSR技術(shù)建立了玉米品種沈玉21的DNA指紋圖譜，成功鑒定了兩份樣品的真?zhèn)危稽S成志等［18］利用SSR分子標記成功鑒定了水稻種子中優(yōu)88、協(xié)優(yōu)88和全豐優(yōu)88的真?zhèn)魏图兌龋Y(jié)果表明SSR分子標記鑒定和田間鑒定的結(jié)果基本上一致；周曄等［19］運用顯微鑒定和ISSR技術(shù)鑒別中藥玉竹（Polygonatum odoratum）及其摻偽品小玉竹（P.humile），結(jié)果顯示通過ISSR標記可以將玉竹及其主要摻偽品區(qū)分開，同時，運用ISSR分子標記技術(shù)能有效的區(qū)分中藥黃精 （P.sibiricum） 和卷葉黃精 （P.cirrhifolium）［20］，保證了用 藥 的安全；羅沛宜［21］通過篩選ISSR引物，找到了特異性的當歸條帶，能成功的對當歸及其混偽品進行鑒別。然而，利用分子標記技術(shù)來鑒定白芨的真?zhèn)芜€未見報道。因此，本研究中建立的白芨分子鑒定體系具有重要的實用意義，為以后的白芨組培苗的分子鑒定提供了依據(jù)，可為白芨屬植物資源的保護、利用和評價奠定良好基礎(chǔ)。

圖3 部分SSR引物（I）和部分ISSR引物（II）對8份材料的擴增電泳圖

表3 7對SSR引物的帶型數(shù)據(jù)統(tǒng)計

表4 8對ISSR引物的帶型數(shù)據(jù)統(tǒng)計

通過實驗發(fā)現(xiàn)，在利用分子標記進行真?zhèn)舞b定時，分子標記要盡量多選，標記少的話，可能會鑒定不出樣品的差異，從而導(dǎo)致結(jié)果錯誤，把假的誤認為真的，本研究中用到的分子標記數(shù)量較多，為試驗結(jié)果的可信度提供了保證。