胃炎靈顆粒劑微生物限度檢查方法驗證

馬海玲，張詠梅，沈花，錢偉

胃炎靈顆粒劑為醫院制劑，由白芍、香附、枳實、川楝子、柴胡、黨參、黃芪及白術等中藥組成，功能疏肝理氣、清肝泄熱、解痙止痛。臨床治療膽汁反流性胃炎療效顯著。本方多藥合用，疏肝郁，安中焦，使脾胃升清降濁氣化復常。

中藥制劑在生產中的各個環節極易被微生物污染，影響藥品的質量及安全，因此藥品的微生物檢驗和微生物限度控制是保障藥品安全性的一項重要舉措［1］。微生物計數法包含平皿法、薄膜過濾法以及最可能數法，平皿法是微生物計數方法中最常用且應用較廣的一種試驗方法。本研究于2018年8—12月參考2015版《中華人民共和國藥典》四部通則1105（微生物計數法）和1106［2］（控制菌檢查法）建立胃炎靈顆粒劑的微生物限度檢查方法，并對該方法進行驗證，以保證胃炎靈顆粒劑的質量，提高檢測效率。

1 儀器與材料

1.1 儀器Milliflex Plus全自動微生物過濾系統（密理博公司）、BHC-1300ⅡA2型生物安全柜（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）、HH-B11-500BS-Ⅱ電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械有限公司）、LMQ-C51L立式滅菌器（山東新華醫療器械股份有限公司）、Transferpette-S移液器（德國普蘭德公司）、HH-W21-600S電熱恒溫水浴箱（上海躍進醫療器械廠）、MJ-150-Ⅱ霉菌培養箱（上海索譜儀器有限公司）、AUX220電子天平（日本島津公司）。

1.2 菌種枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501-2a18］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104-2a16-1］、金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003-5a23-1］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102-3a28-1］、白色念珠菌［CMCC（B）98001-2a11］、黑曲霉［CMCC（B）98003-2a11］，以上菌種均購于中國食品藥品檢定研究院，均為第三代。

1.3 培養基胰酪大豆胨液體培養基（批號20161223）、麥康凱液體培養基（批號20161222）、沙氏葡萄糖液體培養基（批號20160204）、胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號20161219）、麥康凱瓊脂培養基（批號20161107）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號20161123）、PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號20161108），上述培養基均購于青島高科園海博生物技術有限公司，培養基適用性試驗符合2015版《中華人民共和國藥典》規定。4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養基（批號20170721），購于北京牛牛基因技術有限公司。

1.4 樣品胃炎靈顆粒劑（規格：10克/袋；批號170206、170814、180319），自制。

2 方法與結果

2.1 菌液制備（1）將枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌接種至胰酪大豆胨液體培養基中，32℃培養24 h。吸取1 mL枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌的胰酪大豆胨液體培養物，加9 mL PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，采用10倍系列稀釋，使菌落數不大于100 CFU/mL。（2）將白色念珠菌接種至沙氏葡萄糖液體培養基中，25℃培養48 h。取1 mL白色念珠菌的沙氏葡萄糖液體培養物，加9 mL PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，采用10倍系列稀釋，使菌落數不大于100 CFU/mL。（3）將黑曲霉接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養基中，25℃培養7 d，取斜面培養物，用5 mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液洗脫，制備成孢子混懸液［3］。吸取1 mL混懸液，加9 mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，采用10倍系列稀釋，使孢子數不大于100 CFU/mL。

2.2 供試品溶液的制備從同一批次的兩個不同包裝中共稱取胃炎靈顆粒劑10 g，加入PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，混勻，作為1∶10的供試品溶液。

2.3 需氧菌總數計數方法的驗證

2.3.1 常規法

2.3.1.1 試驗組 取5份9.9 mL 1∶10供試液，分別加入2.1項下的相應稀釋級別的5種試驗菌株菌懸液0.1 mL，混勻，使最終試驗組中菌落數不大于100 CFU/mL。分別吸取1 mL上述含菌供試液于平皿中，平行操作制備2塊平皿，加入胰酪大豆胨瓊脂培養基，混勻，32℃倒置培養，培養結束后計數。

2.3.1.2 菌液對照組 取5份9.9 mL PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，分別加入2.1項下的相應稀釋級別的5種試驗菌株菌懸液0.1 mL，混勻，使最終菌液對照組中菌落數不大于100 CFU/mL。其余操作同2.3.1.1試驗組。

2.3.1.3 供試品對照組 取9.9 mL 1∶10供試液，加入PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 mL，不加菌懸液，混勻。其余操作同2.3.1.1試驗組。

2.3.1.4 回收率測定結果 試驗組平均菌落數與供試品對照組平均菌落數的差值與菌液對照組平均菌落數的比值即為各試驗菌株的回收率［4-6］。結果見表1。

表1 常規法測定不同批號胃炎靈顆粒劑需氧菌總數回收率結果

由結果可知，銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率均在0.50～2.00范圍內。枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的回收率分別為0.23、0.16，均低于0.50，常規法不適宜用于需氧菌總數的測定，需更換檢測方法。

2.3.2 培養基稀釋法

2.3.2.1 試驗組 取2份9.9 mL 1∶10供試液，分別加入相應稀釋級別的枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液0.1 mL，混勻，使最終試驗組中菌落數不大于100 CFU/mL。吸取0.2 mL含菌供試液于平皿中，平行操作制備5塊平皿，加入胰酪大豆胨瓊脂培養基，混勻，32℃倒置培養，培養3 d結束后測定5塊平皿菌落數之和。

2.3.2.2 菌液對照組 取2份9.9 mL PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，分別加入相應稀釋級別的枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液0.1 mL，混勻，使最終菌液對照組中菌落數不大于100 CFU/mL。其余操作同2.3.2.1試驗組。

2.3.2.3 供試品對照組 取9.9 mL 1∶10供試液，加入PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 mL，混勻，不加菌懸液。其余操作同2.3.2.1試驗組。

2.3.2.4 回收率測定結果 結果見表2。

表2 培養基稀釋法測定不同批號胃炎靈顆粒劑枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌回收率結果

由結果可知，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的回收率分別為0.32、0.17，均低于0.50，培養基稀釋法不適宜用于上述2種試驗菌的檢測，需更換檢測方法。

2.3.3 薄膜過濾法

2.3.3.1 試驗組 取10 mL 1∶10供試液，用100 mL PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，沖洗3次，在最后1次沖洗液中分別加入相應稀釋級的枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液0.1 mL，過濾，取出濾膜，使菌面朝上放置于預制的胰酪大豆胨瓊脂培養基平板上，置于32℃培養箱中倒置培養3 d后計數。

2.3.3.2 菌液對照組 分別取枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液0.1 mL，用100 mL PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗菌懸液，過濾，取出濾膜。其余操作同2.3.3.1試驗組。

2.3.3.3 供試品對照組 取10 mL 1∶10供試液，用100 mL PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，不加菌懸液，沖洗3次，過濾，取出濾膜。其余操作同

2.3.3.1 試驗組。

2.3.3.4 回收率測定結果 結果見表3。

表3 薄膜過濾法測定不同批號胃炎靈顆粒劑枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌回收率結果

由結果可知，枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的回收率在0.50～2.00范圍內，說明薄膜過濾法可用于胃炎靈顆粒劑需氧菌總數的計數。

2.4 霉菌和酵母菌總數計數方法的驗證

2.4.1 試驗組 取2份9.9 mL 1∶10供試液，分別加入相應稀釋級別的白色念珠菌菌懸液、黑曲霉孢子懸液0.1 mL，混勻，使最終試驗組中菌落數不大于100 CFU/mL。分別吸取1 mL上述含菌供試液于平皿中，平行操作制備2塊平皿，加入沙氏葡萄糖瓊脂培養基，混勻，25℃倒置培養5 d后計數。

2.4.2 菌液對照組 取2份9.9 mL PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，分別加入相應稀釋級別的白色念珠菌菌懸液、黑曲霉孢子懸液0.1 mL，混勻，使最終菌液對照組中菌落數不大于100 CFU/mL。其余操作同2.4.1試驗組。

2.4.3 供試品對照組 取9.9 mL 1∶10供試液，加入PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 mL，不加菌懸液，混勻。其余操作同2.4.1試驗組。

2.4.4 霉菌和酵母菌總數回收率測定結果 結果見表4。

表4 常規法測定不同批號胃炎靈顆粒劑霉菌和酵母菌總數回收率結果

由結果可知，白色念珠菌、黑曲霉的回收率均在0.50～2.00范圍內，說明常規法可用于胃炎靈顆粒劑霉菌和酵母菌總數的計數。

2.5 控制菌檢查方法的驗證

2.5.1 菌液制備 將大腸埃希菌接種至胰酪大豆胨液體培養基中，置于32℃培養箱中培養24 h，吸取1 mL大腸埃希菌的胰酪大豆胨液體培養物，加9 mL PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，采用10倍系列稀釋，使菌落數不大于100 CFU/mL。

2.5.2 供試品溶液的制備 同2.2項。

2.5.3 大腸埃希菌檢查方法適用性試驗

2.5.3.1 試驗組 取9.9 mL 1∶10供試液，加入0.1 mL大腸埃希菌菌懸液，兩者混勻后接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，32℃培養24 h。取上述培養物1 mL接種至100 mL麥康凱液體培養基中，42℃培養48 h。取麥康凱液體培養物，在麥康凱瓊脂培養基上劃線接種，32℃倒置培養72 h［7］。觀察結果。

2.5.3.2 供試品對照組 取10 mL 1∶10供試液接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，其余操作同2.5.3.1試驗組。

2.5.3.3 陽性對照組 取大腸埃希菌菌懸液0.1 mL，接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，其余操作同2.5.3.1試驗組。

2.5.3.4 陰性對照組 取10 mL PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液接種至100 mL胰酪大豆胨液體培養基中［8］，其余操作同2.5.3.1試驗組。

2.5.4 結果判斷 見表5。

表5 控制菌檢查結果

由結果可知，試驗組、陽性對照組有菌落生長，鑒定試驗呈陽性，可判定檢出大腸埃希菌；供試品對照組、陰性對照組無菌落生長。說明胃炎靈顆粒劑的控制菌檢查可采用常規法。

3 討論

胃炎靈顆粒劑為中藥復方制劑，通過多味藥的協同作用發揮藥效，成分復雜，其中某一成分的抑菌作用都有可能會影響微生物限度檢查方法的準確性［9］。采用常規法和培養基稀釋法測定5種試驗菌的回收率時，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均低于0.50。大量研究表明白芍、黃連、梔子、蒲公英、土茯苓均對金黃色葡萄球菌有抑制作用［10-15］。黃芪、黨參、甘草均對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有抑制作用［16-17］。處方中的大量抑菌成分抑制了供試液中菌落的生長，以致測得回收率低于0.50。

采用薄膜過濾法時，枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的回收率分別為0.87、0.97，處于0.50～2.00范圍內，符合標準要求，說明處方中的大量抑菌成分已隨沖洗液沖洗濾過去除。在微生物檢查過程中確保被檢樣品的抑菌活性被消除，才能真實的反應檢驗結果。因此本試驗最終選擇薄膜過濾法進行胃炎靈顆粒劑的需氧菌總數測定是可行的。

黑曲霉在胰酪大豆胨瓊脂培養基和沙氏葡萄糖瓊脂培養基上培養時，菌落蔓延迅速至黑色厚絨狀，難以計數。為避免黑曲霉菌落計數誤差，在瓊脂培養基培養1 d后開始逐日計數，而非培養結束后才開始計數。

本研究經過試驗驗證，建立了胃炎靈顆粒劑的微生物限度檢查方法，結合胃炎靈顆粒劑的生產工藝，參考2015版《中華人民共和國藥典》四部通則1107，進行胃炎靈顆粒劑的微生物限度檢查時，采用薄膜過濾法測定胃炎靈顆粒劑的需氧菌總數，要求每1克胃炎靈顆粒劑中需氧菌總數不得超過1 000 CFU；采用常規法測定霉菌和酵母菌總數，要求每1克胃炎靈顆粒劑中霉菌和酵母菌總數不得超過100 CFU；采用常規法檢查控制菌，要求每1克胃炎靈顆粒劑中不得檢出大腸埃希菌。