落地生根水提物對H22肝癌小鼠免疫功能的影響分析

楊志杰 樊星花 梁宇紅

（廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院暨柳州市工人醫(yī)院藥學(xué)部 廣西 柳州 545005）

落地生根Bryophyllum pinnatum (L.f.) Oken為景天科(Crassulaceae)落地生根屬(BryophllurnSalisb)植物，在廣西、廣東、云南、福建和臺灣等地區(qū)廣泛分布，別名為花蝴蝶、倒吊蓮、土三七、葉生根、番鬼牡丹、葉爆芽、天燈籠、槍刀草、厚面皮、著生藥等，全草入藥，性酸、寒[1]。除具有觀賞價值外，還具有藥用價值，可治創(chuàng)傷出血、疔瘡、乳腺炎、跌打損傷吐血、熱性胃痛、關(guān)節(jié)腫痛、急性中耳炎、皮膚潰瘍等[2]。在國外，落地生根廣泛分布于非洲、美洲熱帶以及印度和澳大利亞，作為傳統(tǒng)藥物用于腹瀉、嘔吐、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗病原微生物、利什曼病及抗變態(tài)反應(yīng)等[3]。本實驗就落地生根對H22肝癌小鼠免疫功能影響做研究，嘗試對落地生根水提物抗腫瘤的作用進行初步探討。

1.資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 細(xì)胞株及動物 小鼠H22肝癌細(xì)胞由廣西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室提供，經(jīng)本實驗室傳代保存。昆明種小鼠60只，體質(zhì)量18～22g，雌雄不拘，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。試驗動物使用許可證 SCXK2009-0002。

1.1.2 藥品與試劑 落地生根采取于廣西來賓市忻城縣，經(jīng)河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院鄧晰朝副教授鑒定為鑒定景天科(Crassulaceae)落地生根屬(BryophllurnSalisb)植物落地生根Bryophyllum pinnatum (L.f.) Oken。氟尿嘧啶注射液（5-FU），天津金耀藥業(yè)有限公司，批號1504261。一得閣墨汁購于一得閣墨業(yè)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器

多功能提取濃縮機組(上海順儀實驗設(shè)備有限公司)；分析天平(日本島津公司)；DRAGON LAB移液器(20～200μL)( 大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司)；酶標(biāo)儀（美國伯樂BIORAD公司）。

1.3 藥材提取

取6100g落地生根干藥材，加10倍量蒸餾水，回流提取3次，每次1小時，過濾，合并3次濾液，濃縮成浸膏，浸膏量為1246.8g，置于4℃冰箱，待用。

1.4 造模、分組及給藥

取凍存的H22肝癌細(xì)胞，復(fù)蘇為0.9%氯NaCL溶液混懸，小鼠腹腔注射，連續(xù)傳兩代。無菌條件下取H22肝癌小鼠腹水，稀釋成含量為1×107·mL-1的細(xì)胞懸液后于小鼠右側(cè)腋窩皮下接種，小鼠接種腫瘤細(xì)胞懸液后稱體重，隨機分為空白組、陽性組（5-FU）、模型組、水提物低劑量組（4g·kg-1生藥量）、中劑量組（8g·kg-1生藥量）及高劑量組（16g·kg-1生藥量）共6組，每組10只。空白組為正常小組，陽性組按20mg·kg-1給予5-FU腹腔注射，模型組、空白組灌服等體積生理鹽水。各組均于接種后24小時開始給藥，每天1次，連續(xù)15天。

1.5 小鼠碳廓清實驗

末次給藥24小時后,尾靜脈注射以生理鹽水稀釋4倍的印度墨汁,每10g體質(zhì)量注射0.1mL，墨汁注入后立即計時，于注入墨汁后第2（t1）、10min（t2），分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20μL，加入到2mL 0.1% Na2CO3溶液中，搖勻。以0.1% Na2CO3溶液作空白對照，用酶標(biāo)儀在600nm波長處比色測定光密度值（OD）。將小鼠處死，取肝、脾，稱質(zhì)量，計算吞噬指數(shù)（a)。吞噬指數(shù)計算方法：K=（lgOD1-lgOD2)/(t2-t1).吞噬指數(shù)（a)=體質(zhì)量×K1/3（肝質(zhì)量+脾質(zhì)量）。

1.6 瘤重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、肝臟指數(shù)的測定

分別稱取小鼠體重，脫頸椎處死小鼠，剝離腫瘤組織，取小鼠脾臟、胸腺和肝臟，精密稱定，計算抑瘤率、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和肝臟指數(shù)：腫瘤抑制率（%）={1-（平均實驗組瘤重/平均對照組瘤重）}×100%；胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量/體重；脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體重；肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量/體重。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2.結(jié)果

2.1 抑瘤作用

研究結(jié)果顯示，與模型組比較，落地生根水提物中、高劑量組可明顯抑制小鼠H22實體瘤生長（P＜0.05)，抑瘤率分別為65.68%和74.56%，與5－氟尿嘧啶作用相當(dāng)，見表1。

表1 落地生根水提物對小鼠瘤重及免疫臟器指數(shù)的影響

2.2 臟器/體重比值的測定

落地生根水提物各劑量組與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P≥0.05)，落地生根水提物中、高劑量顯著增加H22荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)（P＜0.05)，中劑量組顯著增高胸腺指數(shù)（P＜0.05)，詳見表2。

表2 肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)的測定 （±s，mg·g-1）

表2 肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)的測定 （±s，mg·g-1）

注：*表示P＜0.05。

組別 動物數(shù)（只）肝臟指數(shù)脾臟指數(shù)胸腺指數(shù)空白組1062.42±2.12 7.79±1.19*6.94±0.81模型組1056.03±3.436.87±0.486.22±2.20陽性組859.10±2.706.61±0.746.20±0.58低劑量組859.07±3.94 7.51±0.736.33±0.76中劑量組954.74±15.63 7.72±0.88* 7.21±0.88*高劑量組1060.20±1.857.77±0.83*6.32±1.26

2.3 小鼠碳廓清試驗

落地生根水提物各劑量組小鼠碳廓清吞噬指數(shù)與模型組比較，中、高劑量組有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)，詳見表3。

表3 碳廓清試驗（±s）

表3 碳廓清試驗（±s）

注：*表示P＜0.05。

組別動物數(shù)（只）吞噬指數(shù)（a)空白組100.56±0.35模型組10 0.24±0.13陽性組80.52±0.14*低劑量組80.39±0.15中劑量組90.47±0.21*高劑量組100.44±0.14*

3.討論

近年來，中醫(yī)藥的應(yīng)用在原發(fā)性肝癌的綜合治療中起著舉足輕重的作用，越來越多的有效抗癌成份已從中藥材中提取獲得，中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡時，其對正常細(xì)胞的毒性遠低于化療藥物，對正常組織細(xì)胞傷害很小，能改善患者全身癥狀，提高患者生存質(zhì)量，與化療藥物合用具有減毒增效的作用，同時，許多具有抗腫瘤作用的中藥在治療腫瘤的同時又能積極保護或增強免疫功能[4,5]。本實驗通過動物實驗初步發(fā)現(xiàn)落地生根水提物具有抗腫瘤及增強免疫功能作用。

脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)能夠反映機體非特異性免疫能力[6]。本實驗采用不同濃度的落地生根水提物作用于H22荷瘤小鼠，發(fā)現(xiàn)中、高劑量可以增加H22荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)（P＜0.05)，中劑量顯著增高胸腺指數(shù)（P＜0.05)，能夠提高荷瘤小鼠的非特異性免疫能力，對免疫器官有一定的保護作用。中、高劑量落地生根水提物能夠有效抑制H22荷瘤小鼠的體內(nèi)腫瘤生長，與陽性藥5－氟尿嘧啶作用效果相當(dāng)。碳廓清試是檢測機體非特異性免疫功能的常用方法之一，顆粒狀異物進入血液循環(huán)后，能迅速被巨噬細(xì)胞吞噬，若將異特量恒定，測定異物在血液中的消除速率可以反映巨噬細(xì)胞的吞噬功能[7]，本研究結(jié)果顯示落地生根水提物的中、高劑量組均可增加碳廓清指數(shù)，反映其可以調(diào)節(jié)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用。

綜上所述，落地生根水提物對H22荷瘤小鼠的免疫系統(tǒng)有一定的保護作用，能增強機體的免疫功能，提高抗腫瘤能力，具體的作用機制及作用靶點有待進一步研究。