LC-MS/MS測定沙卡布曲纈沙坦鈉中的基因毒性雜質

馬平平，周君安，孫 琳

(江蘇豪森藥業集團有限公司， 江蘇 連云港 222000)

沙卡布曲纈沙坦鈉(Sacubitril/Valsartan)是2015年FDA批準的治療心力衰竭藥物Entresto(沙卡布曲纈沙坦鈉)[12]。5-(4'-疊氮甲基-[1,1'-二苯基]-2-基)-1H-四氮唑是合成沙卡布曲纈沙坦鈉合成的中間體，屬于潛在的基因毒性雜質[3]。根據美國食品和藥物管理局(FDA)和國際藥品注冊協調會議(ICH)關于基因毒性雜質的指導原則要求，本文擬建立采用LC-MS/MS測定本品合成中間體5-(4'-疊氮甲基-[1,1'-二苯基]-2-基)-1H-四氮唑的含量方法。

1 儀器與試劑

儀器：XS105電子分析天平(瑞士METTLER公司)；UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國戴安公司)；TSQ Quantum Ultra 三重四級桿串聯質譜儀，配有電噴霧離子源(美國Thermo Scientific公司)。

試劑：乙酸銨(色譜純，上海安譜科學儀器公司)；乙腈(色譜純，Fisher公司)；甲醇(色譜純，Fisher公司)；超純水(屈臣氏)；5-(4'-疊氮甲基-[1,1'-二苯基]-2-基)-1H-四氮唑(本公司自制)

2 實驗方法與結果

2.1 色譜-質譜條件

色譜條件：照高效液相色譜-質譜法(中國藥典2015年版四部通則0512和中國藥典2015年版四部通則0431)，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Agilent Poroshell120 EC-C18 50×4.6mm，2.7μm或柱效類似的色譜柱)，以0.01mol/L乙酸銨為流動相A，甲醇-乙腈(20∶80)為流動相B，流速為每分鐘0.3mL，柱溫25℃，梯度洗脫程序t：0-6-15-15.1-18 min，流動相比例B%：35%-50%-35%-35%，柱溫為40℃，進樣量為5 μL。

質譜檢測器參數如下(質譜參數根據具體儀器可進行調整以滿足系統適用性)：掃描模式為ESI(-)、SRM模式，離子噴霧電壓為3000V，離子源溫度為300℃，鞘氣壓力為30arb，輔助氣壓力為5arb，離子傳輸毛細管溫度為300℃，設置管狀透鏡補償電壓分別為-56V，選擇質荷比(m/z)為276.1/192.1離子對進行檢測，碰撞能量為14V。

2.2 溶液配制

2.2.1 供試品溶液

取沙卡布曲纈沙坦鈉適量，精密稱定，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液

精密稱取5-(4'-疊氮甲基-[1,1'-二苯基]-2-基)-1H-四氮唑約45mg，置100mL的量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1mL，置100mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取1mL，置100mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻作為對照品溶液(45ng/mL)。

2.3 分析方法確證

2.3.1 質譜分析

將對照品溶液采用蠕動泵進樣模式，進行全掃描(full scan)形式分析檢測，選擇質荷比(m/z)為276.1/192.1離子對進行檢測。

2.3.2 方法的專屬性

在所確定的色譜-質譜條件下，對空白溶液(甲醇)和對照品溶液(45ng/mL)進行檢測，考察方法的專屬性，色譜圖見圖1～圖2。結果表明：在該色譜條件下，空白溶液不干擾雜質的檢測，專屬性良好。

圖1 空白溶液LC-MS圖

圖2 對照品溶液LC-MS圖

2.3.3 線性關系考察

精密稱取對照品約45mg，置100mL的量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1mL，置100mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取10mL，置100mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為儲備溶液(450ng/mL)，精密量取該儲備液1，2，5，10，20mL置100mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成每1mL中各含雜質10294-0315為4.51，9.02，22.56，45.12，90.24ng的系列標準溶液；精密量取上述系列標準溶液各5μl，分別注入液相色譜-質譜儀中，記錄色譜圖，量取峰面積。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，雜質10294-0315線性回歸方程為：A = 516.9206×C+48.1259，r=0.9997，說明雜質10294-0315在4.51ng/mL～90.24ng/mL范圍內線性良好測定結果見下表1。

表1 5-(4'-疊氮甲基-[1,1'-二苯基]-2-基)-1H-四氮唑對照品的線性方程及相關系數

2.3.4 定量限與檢測限

在本試驗條件下，配制不同濃度的5-(4'-疊氮甲基-[1,1'-二苯基]-2-基)-1H-四氮唑對照品，檢測限以S/N≥3計，定量限以S/N≥10計，分別進樣確定5-(4'-疊氮甲基-[1,1'-二苯基]-2-基)-1H-四氮唑的檢測限和定量限，實驗結果見下表2。

表2 5-(4'-疊氮甲基-[1,1'-二苯基]-2-基)-1H-四氮唑對照品的檢測限和定量限

2.3.5 方法準確度

雜質儲備溶液：精密稱取對照品約45mg，置100mL的量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1mL，置100mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取10mL，置100mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為儲備溶液(450ng/mL)。

供試品溶液：分別精密量取雜質儲備溶液0.15，1.0，1.5mL置10mL量瓶中，分別向上述量瓶中加入約0.12g沙卡布曲纈沙坦鈉，加甲醇分別配制成含雜質約6.75，45，67.5ng/mL的供試品溶液，平行三份。

精密量取上述溶液各5μl，分別注入液相-質譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，計算回收量和回收率。實驗結果見表3。

表3 方法的回收率及精密度(n=9)

從上述系列表可以看出，伊馬胺測定平均回收率為 94.3%，RSD為 6.9%(n=12)，表明該方法檢測5-(4'-疊氮甲基-[1,1'-二苯基]-2-基)-1H-四氮唑的準確度很好。

3 討論

本文建立的沙卡布曲纈沙坦鈉中潛在的基因毒性雜質5-(4'-疊氮甲基-[1,1'-二苯基]-2-基)-1H-四氮唑的含量LC-MS/MS檢測方法，簡單、快速、方法靈敏度和準確度高，實用性強，為相關的藥品檢測工作提供了快速準確的技術支持，可為藥品安全，保證人體健康提供技術保障。