調節性T細胞及白細胞介素17在子宮內膜癌患者中的表達及意義

唐婷婷 趙曼曼

[摘要] 目的 研究調節性T細胞及白細胞介素17（IL-17）在子宮內膜癌患者中的表達及意義。 方法 選取2013年1月～2016年1月我院收治的20例子宮內膜癌患者作為子宮內膜癌組，另選取同期20名健康志愿者作為對照組，應用流式細胞術檢測兩組外周血中調節性T細胞水平。采用realtime-PCR及ELISA檢測調節性T細胞轉錄因子Foxp3、抑制性細胞因子白細胞介素10（IL-10）及炎性細胞因子IL-17的水平。 結果 子宮內膜癌患者外周血中調節性T細胞的水平及Foxp3表達水平顯著高于對照組，差異具有統計學意義（P<0.01）。同時子宮內膜癌患者IL-10及IL-17的分泌水平也顯著高于對照組，差異具有統計學意義（P<0.01）。 結論 子宮內膜癌患者調節性T細胞/Th17細胞間的平衡被打破，調節性T細胞可能通過分泌IL-10參與調控子宮內膜癌的病理進程。

[關鍵詞] 子宮內膜癌;調節性T細胞;白細胞介素17;白細胞介素10

[中圖分類號] R737.33? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）27-0033-03

[Abstract] Objective To study the expression and significance of regulatory T cells and interleukin 17（IL-17） in the patients with endometrial cancer. Methods 20 patients with endometrial cancer who were admitted to our hospital from January 2013 to January 2016 were selected in the endometrial cancer group. Another 20 healthy volunteers during the same period of time were selected in the control group. Flow cytometry was used to detect regulatory T cell levels in peripheral blood of both groups. Real-time PCR and ELISA were used to detect the levels of regulatory T cell transcription factor Foxp3， inhibitory cytokine interleukin 10（IL-10） and inflammatory cytokine IL-17. Results The levels of regulatory T cells and the expression level of Foxp3 in peripheral blood of patients with endometrial cancer were significantly higher than those in the control group， and the differences were statistically significant（P<0.01）. At the same time， the secretion levels of IL-10 and IL-17 in the patients with endometrial cancer were significantly higher than those in the control group， and the difference was statistically significant（P<0.01）. Conclusion The balance between regulatory T cells/Th17 cells in the patients with endometrial cancer is broken. Regulatory T cells may be involved in the regulation of the pathological process of endometrial cancer by secreting IL-10.

[Key words] Endometrial cancer; Regulatory T cells; Interleukin 17（IL-17）; Interleukin 10 （IL-10）

子宮內膜癌發生于子宮內膜上皮組織，是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一[1]。有研究顯示大量的免疫細胞及相關炎性因子浸潤到腫瘤組織間質中，對子宮內膜癌的病理進程發揮調控作用[2]。其中調節性T細胞最為引人關注。有研究者發現在子宮內膜癌患者腫瘤局部CD4+CD25+Treg比例增高，并認為這種升高在一定程度上歸因于患者的年齡或絕經后狀態[3]。研究證實Treg細胞表面分子GITR在腫瘤組織中的表達明顯高于外周血中的表達[4]。同時研究人員還發現子宮內膜癌患者中調節性T細胞/殺傷性T細胞比例高者，預后較差，無病生存期明顯縮短，提示調節性T細胞可能是子宮內膜癌的獨立預后因素[5]。

輔助性Th17型細胞以分泌白細胞介素17（IL-17）為特征，可通過誘導產生多種炎性細胞因子，參與構成腫瘤微環境[6]。現有研究顯示Th17細胞與子宮內膜癌存在相關性，但其具體作用機制尚未闡明。盡管有研究顯示Th17細胞的數量及特異性細胞因子的水平隨腫瘤的進展始終維持在高水平[7]，但也有研究證實子宮內膜癌患者外周血血清中IL-17的水平并沒有顯著升高[8]。因此Th17在子宮內膜癌患者中的表達及作用有待進一步確證。同時調節性T細胞在子宮內膜癌中的作用及其與Th17免疫反應中的相互關系亟待研究。

1資料與方法

1.1一般資料

選自沈陽市第四人民醫院2013年1月-2016年1月就診子宮內膜癌患者20例，且經病理學檢查確診。年齡32～59歲，平均（42.8±9.0）歲，均未進行過放、化療及激素或免疫等抗腫瘤治療。對照組根據年齡匹配選取20名健康志愿者，年齡36～55歲，平均（44.6±8.5）歲。兩組年齡差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

本研究獲醫院倫理委員會批準，所有被檢者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1 流式細胞術檢測調節性T細胞水平? 采集各組研究對象外周血2.5 mL，置于EDTA抗凝管中，加入淋巴細胞分離液，離心，分離獲得PBMC，計數。取1×106 PBMC，加入anti-CD4-FITC及anti-CD25-APC進行細胞表面染色，4℃，2 h。破膜固定后，加入anti-Foxp3-PE進行胞內染色，清洗，重懸細胞，上機檢測。anti-CD4-FITC、anti-CD25-APC及anti-Foxp3-PE均購自美國BD bioscience公司。

1.2.2 realtime-PCR檢測組織Foxp3的表達水平? 患者行切除術后，取1 cm×1 cm×1 cm 新鮮腫瘤組織，液氮保存。對照組取診刮后子宮內膜，PBS清洗后，液氮保存。Trizol法提取組織塊總RNA，應用Takara RT kit 將RNA逆轉錄為cDNA，應用ABI7500實時熒光定量PCR儀檢測肺組織中細胞因子Foxp3 mRNA的表達水平。引物設計合成由大連寶生物公司提供：Foxp3上游引物5-CCACCTGGAAGAACGCCAT-3，下游引物5-CACTTCTTGGTCCCTGTGGG-3。β-actin上游引物5-CATTCCAAATATGAGATGCGTTGT-3，下游引物5-GCTATCACCTCCCCTGTGTG-3。

1.2.3 酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測IL-17、IL-10的分泌水平? 抽取各組研究對象外周血，室溫靜置2 h，1500 rpm，離心30 min，分離上清，-70℃保存，待測。取100 μL稀釋的血清樣品或梯度稀釋的標準品，加入預先包被好的96孔板中。室溫孵育2 h，PBS洗板3次。加入檢測抗體100 μL，室溫孵育2 h，PBS洗板3次。加入Streptavidin-HRP 100 μL，避光孵育20 min，洗板3次。加底物避光室溫孵育30 min，加終止液50 μL。利用酶標儀，在450 nm處讀板計算蛋白濃度。

1.3 觀察指標

記錄對比兩組標本中的調節性T細胞、Foxp3、IL-17及IL-10的表達水平，并分析上述指標與子宮內膜癌的密切關系。

1.4 統計學分析

采用SPSS16.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差表示，利用兩組獨立樣本t檢驗進行組間比較，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞及特異性轉錄因子Foxp3表達水平比較

為證實調節性T細胞在子宮內膜癌病理進程中是否發揮作用，采用流式細胞術檢測患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞水平，同時進一步采用實時定量熒光PCR檢測調節性T細胞特異性轉錄因子Foxp3的表達水平。結果表明，子宮內膜癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞占CD4+T細胞的比例及子宮內膜癌患者局部組織中Foxp3的mRNA表達水平較對照組均顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.01）。見表1。

2.2 兩組外周血中IL-17及IL-10分泌水平比較

酶聯免疫吸附法檢測對照組及患者外周血血清中細胞因子的分泌水平。結果顯示，子宮內膜癌患者血清中IL-17及IL-10的分泌水平較對照組均明顯升高，差異均具有統計學意義（P<0.01）。見表2。

3討論

子宮內膜癌作為最常見的女性生殖系統惡性腫瘤之一，其致死率僅次于卵巢癌和宮頸癌，居婦科惡性腫瘤的第三位[9]。近年來，研究顯示子宮內膜癌間質中浸潤有大量的免疫細胞，免疫細胞與其所分泌的細胞因子共同構成了腫瘤的微環境，同時它們在子宮內膜癌的發生發展過程中也發揮舉足輕重的作用，但其具體調控機制尚不十分清楚[10]。

調節性T細胞是一類具有免疫抑制功能的T細胞亞群，以表達CD4、CD25及Foxp3為特征性表型，不僅能對抗外源性抗原，還可以抑制自身抗原的免疫應答，從而輔助腫瘤細胞逃避機體免疫系統的識別及清除[11]。同時有研究表明調節性T細胞在婦科腫瘤的發生發展中也發揮了重要的作用。有研究顯示調節性T細胞介導宮頸癌的免疫逃逸[12-13]，同時在卵巢癌、胃癌、肺癌等多種腫瘤患者外周血中調節性T細胞的比例也顯著升高[14-16]，但調節性T細胞對子宮內膜癌的作用研究尚不足。

本研究中子宮內膜癌患者外周血中調節性T細胞的數量及功能均有明顯升高，表明調節性T細胞參與調控了子宮內膜癌的病理進程。進一步檢測調節性T細胞功能性轉錄因子Foxp3的表達水平，發現子宮內膜癌患者病灶組織中Foxp3的表達水平顯著升高，提示調節性T細胞不僅在數量上顯著增加，而且其免疫調節功能也明顯上調。IL-10作為調節性T細胞，是發揮免疫抑制功能的主要細胞因子，參與調控多種腫瘤的發生發展。在子宮內膜癌患者外周血中，IL-10的分泌水平顯著增加，表明調節性T細胞可能同樣通過分泌IL-10來發揮其對子宮內膜癌病理進程的調控作用。另一方面，以分泌IL-17為主要特征的Th17型免疫細胞被證實參與子宮內膜的多種炎癥發生過程。本研究中子宮內膜癌患者外周血中IL-17的分泌水平顯著升高，提示Th17型炎癥反應在子宮內膜癌患者中被大量誘導。調節性T細胞和Th17細胞均顯著增加，意味著調節性T細胞和Th17細胞間相互平衡被打破，形成了有利于腫瘤發展的免疫炎性微環境。

綜上所述，通過本文研究結果及臨床報道結果顯示， 子宮內膜癌患者血清調節性T細胞及 IL-17 水平較正常人群明顯升高，調節性T細胞及 IL-17 水平檢測有助于對子宮內膜癌診斷及其治療，并且對病情發展程度判斷亦有一定的臨床價值。

[參考文獻]

[1] 陳曉斐，王鵬飛，劉晨晨，等. FIGOI期子宮內膜癌患者159例愈合影響因素[J].中華腫瘤防治雜志， 2019，26（6）：416-420.

[2] 呂巧英，趙洪波，陳曉軍，等.子宮內膜癌腫瘤微環境的免疫調控進展[J].復旦學報，2016，43（4）：475-478.

[3] Sawan S，Burt DJ，Stern PL，et al. Circulating regulatory T cells in endometrial cancer：A role for age and menopausal status[J]. Immunol Invest，2011，40（1）：62-75.

[4] Chang WC， Li CH， Huang SC， et al. Clinical significance of regulatory T cells and CD8+ effector populations in patients with human endometrial carcinoma[J]. Cancer，2010，116（24）：5777-5788.

[5] Yamagami W，Susumu N，Tanaka H，et al. Immunofluorescence-detected infiltration of CD4+FOXP3+regulatory T cells is relevant to the prognosis of patients with endometrial cancer[J]. Int J Gynecol Cancer，2011，21（9）：1628-1634.

[6] Ariafar A，Faghih Z，Zeighami S，et al. 967-Double positive IFNγ/IL17 CD4+ lymphocytes play a pathogenic role in bladder cancer[J]. European Urology Supplements，2017， 3（16）： e1685-e1686.

[7] Guéry L，Hugues S. Th17 Cell plasticity and functions in cancer immunity[J]. Biomed Res Int，2015，2015：314620.

[8] Punt S，Fleuren GJ，Kritikou E，et al. Angels and demons：Th17 cells represent a beneficial response， while neutrophil IL-17 is associated with poor prognosis in squamous cervical cancer[J]. Oncoimmunology，2015， 4（1）：e984539.

[9] 劉睿倩. 乳腺癌基因-1和CA125在子宮內膜癌患者中的表達及意義[J].中華全科醫學，2017，15（1）：88-92.

[10] Dossus L，Lukanova A，Rinaldi S，et al. Hormonal，metabolic，and inflammatory profiles and endometrial cancer risk within the EPIC cohort-a factor analysis[J]. Am J Epidemiol.，2013，177（8）：787-799.

[11] 王凱陽，隋曉露，陳繼紅.細胞亞群與CD4～+ CD25～+調節性T細胞及Foxp3 mRNA在腎移植大鼠急性排斥反應中的作用[J].中華實用診斷與治療雜志，2017，3（31）：218-223.

[12] 肖菊.調節性 T 細胞在宮頸癌患者腫瘤組織中的浸潤情況和臨床意義[J].中國婦幼保健，2018，33（1）：27-29.

[13] 張慧莉，鮑引娣，王書琴，等. Th17/Treg 細胞與宮頸癌 HPV 感染類型的關系[J]. 中國婦幼保健，2018，33（17）：4018-4021.

[14] 戴然，桑秀麗. 調節性T細胞在不同分期卵巢癌患者中的臨床意義[J]. 實用癌癥雜志，2018，33（10）：1590-1592.

[15] Xu Liu，Danhua Xu，Chen Huang，et al. Regulatory T cells and M2 macrophages present diverse prognostic value in gastric cancer patients with diferent clinicopathologic characteristics and chemotherapy strategies[J]. Journal of Translational Medicine，2019，17（192）：2-11.

[16] 付承林，趙秀敏，陳靈斌，等. HBV感染型原發性肝癌患者腫瘤微環境中T細胞亞群及VEGF表達水平及臨床意義[J].中華醫院感染學雜志，2017，7（27）：1490-1494.

（收稿日期：2019-06-10）