p16基因與BAP1蛋白表達缺失在腹膜惡性間皮瘤診斷和鑒別診斷中的作用

高志斌 王兆平 徐瑛 傅家欣

[摘要] 目的 探討p16基因及BRCA相關蛋白1（BAP1）表達缺失在腹膜惡性間皮瘤（PMM）病理診斷和鑒別診斷中的應用價值。 方法 選取我院2010年1月～2018年12月確診為PMM的40例以及各30例卵巢漿液性癌和反應性間皮細胞增生病例作為研究對象。采用熒光原位雜交（FISH）方法檢測p16基因在PMM和反應性間皮細胞增生中表達缺失，以及免疫組織化學方法檢測BAP1在PMM、卵巢漿液性癌及反應性間皮細胞增生中的表達缺失，分析兩者在PMM病理診斷和鑒別診斷中的作用。 結果 PMM標本中p16基因表達缺失率為45%，反應性間皮細胞增生標本中缺失率為0。PMM標本中p16基因表達缺失率高于反應性間皮細胞增生，差異有統計學意義（P<0.01）。BAP1在PMM、卵巢漿液性癌、反應性間皮細胞增生標本中的表達缺失率分別為65%、0和0，BAP1在PMM與卵巢漿液性癌和反應性間皮細胞增生的表達缺失率差異有統計學意義（均P<0.01）。 結論 p16基因表達缺失在診斷和鑒別診斷PMM時有明確的診斷價值。BAP1在PMM與反應性間皮細胞增生和卵巢漿液性癌進行鑒別診斷時，也有確切的診斷價值，可作為又一項重要的免疫組化診斷指標。

[關鍵詞] 腹膜惡性間皮瘤;卵巢漿液性癌;反應性間皮細胞增生;免疫組織化學;p16;BAP1

[中圖分類號] R735.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）27-0131-04

[Abstract] Objective To investigate the value of p16 gene and BRCA-related protein 1（BAP1） expression loss in the pathological diagnosis and differential diagnosis of peritoneal malignant mesothelioma（PMM）. Methods 40 patients with PMM diagnosed in January 2010 and December 2018， and 30 cases of ovarian serous carcinoma and reactive mesothelial cell hyperplasia were selected as subjects. Fluorescence in situ hybridization（FISH） was used to detect the loss of expression of p16 gene in PMM and reactive mesothelial cell proliferation， and immunohistochemistry was used to detect the expression loss of BAP1 in PMM， ovarian serous carcinoma and reactive mesothelial cell proliferation. The role of both in the pathological diagnosis and differential diagnosis of PMM was analyzed. Results The loss rate of p16 gene expression in PMM specimens was 45%， and the loss rate in reactive mesothelioma specimens was 0. The loss rate of p16 gene expression in PMM specimens was higher than that in reactive mesothelial cells， and there was significant difference（P<0.01）. The expression loss rate of BAP1 in PMM， ovarian serous carcinoma， and reactive mesothelial cell proliferation specimens was 65%， 0 and 0， respectively. There were significant statistical differences in the expression loss rate of BAP1 between PMM and ovarian serous carcinoma and reactive mesothelial cell proliferation（all P<0.01）. Conclusion The loss of p16 gene expression has a clear diagnostic value in the diagnosis and differential diagnosis of PMM. BAP1 has a definite diagnostic value in the differential diagnosis of PMM with reactive mesothelial cell proliferation and ovarian serous carcinoma， and can be used as another important immunohistochemical diagnostic index.

[Key words] Peritoneal malignant mesothelioma; Ovarian serous carcinoma; Reactive mesothelial cell proliferation; Immunohistochemistry; p16; BAP1

腹膜惡性間皮瘤（peritoneal malignant mesothelioma，PMM）是指來自腹膜間皮細胞的原發性高度惡性腫瘤，在病理組織形態學上分為上皮型、肉瘤型和混合型，其中上皮型最為常見，而上皮型PMM與同在盆腔的卵巢漿液性癌以及腹膜反應性間皮細胞增生組織形態學上有相似之處，鑒別診斷困難。PMM的診斷通常需要結合病史、臨床資料、腹水腫瘤標志物、影像學資料，以及病理組織學形態、免疫組織化學和分子生物學檢測等方法進行綜合判斷才能確診。即使已有多樣的輔助診斷方法，PMM的診斷至今仍然比較困難[1-2]。近年來有關p16基因和BAP1蛋白表達缺失在PMM中的研究，國外報道相對較多，國內報道很少。本文收集40例PMM病例，結合有關文獻進行探討。

1 資料與方法

1.1一般資料

收集本院2010年1月～2018年12月臨床病理確診為PMM的病例共40例，全部為女性，年齡44～72歲，中位年齡56歲，其中30例有20～40年手紡石棉史，標本均為腫瘤切除術大標本。其中上皮型32例，雙相型8例。40例病例中有19例術前即被初診為PMM，其他被初診為卵巢癌12例，盆腔惡性腫瘤9例。選取同期30例卵巢漿液性癌（年齡48～76歲，中位年齡58歲）根治術大標本以及30例反應性間皮細胞增生病例標本作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 組織學? 組織標本采用中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋，4 μm厚切片以及HE染色，全部PMM、卵巢漿液性癌以及反應性間皮細胞增生病例病理診斷均由兩位以上的高級職稱醫師進行復核，PMM病理診斷嚴格參照文獻中要求的診斷標準[3-4]。

1.2.2 免疫組織化學染色? 組織標本進行免疫組化EnVision染色，采用微波抗原熱修復法，DAB顯色。所用多克隆BAP1一抗（濃縮型）為abcam公司產品，二抗試劑盒為福建邁新生物科技有限公司產品。

1.2.3 FISH檢測? 按照說明書進行樣本準備與變性、探針混合物準備與變性、玻片洗滌、結果觀察等。實驗采用北京金菩嘉醫療科技有限公司的第17號染色體著絲粒探針/第9號染色體p16基因位點特異性探針。GLP p16由四甲基羅丹明標記，在熒光顯微鏡下呈紅色信號。CSP17由細胞綠進行標記，在熒光顯微鏡下呈綠色信號。結果判定：正常細胞均表現為二倍體，細胞核內分別可見2個紅色和2個綠色信號。p16基因缺失表現為每個細胞核內只出現2個信號。每一例計數至少100個不重疊的細胞核，≥10%的腫瘤細胞胞核紅色純合丟失并至少有1個綠色信號被判斷為陽性[5，6]。

1.3 統計學方法

應用SPSS19.0統計軟件對數據進行統計學處理，計數資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FISH檢測PMM和反應性間皮細胞增生標本中p16基因缺失的情況

40例PMM標本中，18例（45%）發生p16基因缺失。30例反應性間皮細胞增生標本中均未檢測出p16基因缺失。PMM標本中p16基因缺失率高于反應性間皮細胞增生，差異有統計學意義（χ2=18.173，P<0.01）（封三圖3、4）。

2.2 免疫組化檢測PMM、反應性間皮細胞增生和卵巢漿液性癌標本中BAP1蛋白的表達缺失情況

BAP1可同時表達于細胞核和細胞漿，主要以細胞核為陽性表達部位，陽性表達為出現黃色或棕色顆粒。40例PMM中26例陰性表達，BAP1基因表達缺失率為65%（封三圖3）。30例卵巢漿液性癌均呈陽性表達，BAP1基因表達缺失率為0，BAP1在PMM與卵巢漿液性癌的表達缺失率差異有統計學意義（χ2=31.023，P<0.01）。30例間皮細胞反應性增生也均呈陽性表達，BAP1基因表達缺失率也為0，BAP1在PMM與間皮細胞反應性增生的表達缺失率差異也有統計學意義（χ2=31.023，P<0.01）（表1，封三圖5～7）。

3討論

腹膜惡性間皮瘤（PMM）是一種原發于腹膜的高度惡性腫瘤，臨床上較少見，病因和發病機制不明，部分病例認為與石棉接觸有關。文獻中報道男性患者居多[5]。本組資料中的病例全部為女性，與文獻報道不一致，這與本地區從事手紡石棉工作的全部為女性有關。本組病例中30例有明確手紡石棉史，從事時間1.5～18年不等。

PMM發病緩慢，潛伏期可長達15～50年，發現時已多為晚期，又由于惡性程度極高，多數患者生存期不超過12個月。患病早期可出現腹部不適，常被患者忽略，在疾病晚期才出現腹水、腹痛及消化道梗阻等[5]。由于本地區是國內石棉加工行業的主要區域之一，2000～2010年女性腹膜惡性間皮瘤發病率為5.7/100萬，PMM病例相對高發[7]。因此臨床醫師在遇到盆腔惡性腫瘤時常會詢問患者有無石棉接觸史，并會根據臨床癥狀和影像學資料考慮到有無PMM這種少見盆腔惡性腫瘤的可能，本組病例中就有19例臨床初診為PMM。

PMM的診斷主要依靠病理學檢查，結合有無石棉接觸史以及影像學改變等資料進行綜合分析。在進行病理診斷時需要與反應性間皮細胞增生、卵巢漿液性癌等多種良惡性病變進行鑒別診斷[4-5]。免疫組織化學檢測最常采用國際上通用的兩陽、兩陰聯合診斷方法，但是PMM的病理診斷仍然十分困難[3-5]。近年來研究發現，在惡性間皮瘤細胞的形成、生長、浸潤和轉移過程中，p16基因異常是最常見的基因改變。p16基因存在于正常細胞中，它是一個細胞周期素依賴性蛋白激酶，它調節RB通路，使細胞停滯于G0期或G1期，失去了CDK4的抑制作用，細胞過度增殖生長，導致腫瘤的發生、發展。熒光原位雜交（FISH）技術常應用于檢測惡性間皮瘤p16基因的缺失[6，8]。Illei等[9]利用FISH檢測95例胸膜間皮瘤冷凍標本中p16和MTAP基因的缺失情況，發現p16的純合子缺失在大多數間皮瘤中均可檢查到，在大多數病例中MTAP與其共缺失。對間皮瘤的組織學亞型進行分析發現，與上皮型相比，這種基因缺失更容易發生在肉瘤型間皮瘤中（包括混合型或者純肉瘤型），但是并沒有統計學意義，這可能是由于樣本量較小造成的。多數研究還顯示[10-13]p16的缺失可用于反應性和腫瘤性的間皮細胞增生的鑒別，而且FISH的敏感性及特異性均高于免疫組織化學方法，用FISH檢測石蠟包埋組織中9p21純合子缺失是診斷惡性間皮瘤和間皮反應性增生的有效方法。本文研究結果顯示，用FISH法檢測出40例PMM標本中p16基因表達缺失率為45%（18/40），30例反應性間皮細胞增生標本中表達缺失率為0（0/30），PMM標本中p16基因的缺失率高于間皮細胞反應性增生，差異有統計學意義（P<0.01），運用FISH檢測p16基因缺失在診斷和鑒別診斷PMM時有明確的病理診斷價值。

BAP1（BRCA-associated protein 1）是一種腫瘤抑制基因，其基因突變或表達水平的下調能夠顯著提高多種腫瘤的易患性。研究表明，BAP1 與許多腫瘤的發生發展關系密切[14-15]。一些研究顯示BAP1還可以鑒別間皮細胞反應性增生和惡性間皮瘤[16-18]，與本文研究結果是一致的，本組資料中30例反應性間皮細胞增生標本均呈BAP1陽性表達（表達缺失率為0），而40例PMM標本中BAP1基因表達缺失率為65%，差異有統計學意義（P<0.01）。PMM在臨床上常被誤診為卵巢漿液性癌，其在病理組織形態上也與卵巢漿液性癌十分相似，也需要進行鑒別診斷。Andrici J的研究顯示[19-20]，BAP1在卵巢漿液性癌中的表達缺失率為0.3%，明顯低于PMM的67%，與本文結果也是基本一致的。本組資料30例卵巢漿液性癌標本均呈BAP1基因表達缺失率為0，BAP1在PMM與卵巢漿液性癌的表達缺失率差異也有統計學意義（P<0.01）。本文研究結果表明BAP1在鑒別PMM與反應性間皮細胞增生和卵巢漿液性癌中均有重要價值。

綜上所述，在PMM標本中p16基因常發生表達缺失。p16基因表達缺失在PMM的發生、發展中發揮重要的作用。運用FISH檢測p16基因表達缺失是鑒別PMM與良性間皮細胞增生的一種有效的方法。而BAP1基因表達缺失與PMM也密切相關，這一免疫標記可以用于鑒別診斷PMM與反應性間皮細胞增生和卵巢漿液性癌，并能與其他診斷PMM的免疫組化抗體一同運用，提高PMM的病理診斷準確性。

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（收稿日期：2019-03-19）