谷氨酰胺轉氨酶改性核桃谷蛋白的結構表征分析

張愛琴 齊鳳敏 趙愛萍 馬舒婕 程怡媚孫 乾 李 芳 王曉雯 孔令明

(新疆農業大學食品科學與藥學學院1，烏魯木齊 830052) (甘肅省隴東學院農林科技學院2，慶陽 745000) (新疆輕工職業技術學院3，烏魯木齊 830021) (新疆正生營養研究院(有限公司)4，昌吉 831100)

谷氨酰胺轉氨酶(E.C. 2.3.2 13)也被稱作轉谷氨酰胺轉氨酶(Transglutaminase，TGase或TG酶)。是一種從微生物體中提取的，具有定向性催化轉酰基化反應，并能夠促進蛋白質分子內和分子間發生酰基化轉移的生物性酶[1]。

TG酶可以使蛋白質中肽鏈上的谷氨酰胺殘基與酰基發生酰基轉移化，導致蛋白質分子內和分子間形成ε-(γ-谷氨酰基)賴氨酸共價鍵[2]，對于植物性蛋白與動物性蛋白的蛋白分子都具有一定的催化交聯作用，對蛋白功能特性和質構特性具有一定程度的改善。

TG酶還能有效地改善蛋白質的溶解性、持水性等功能特性，催化植物性蛋白(大豆、花生蛋白)的分子結構和功能性質發生變化，使食品外觀化、風味化以及質構性具有相應的改變，賦予蛋白新的質構以及口感，在大豆分離蛋白的改性上也有較多的運用[3]，能夠使改性后的大豆蛋白在乳化穩定性、起泡性、凝膠性以及熱穩定性上有較為顯著的改變。Qin等[4]的研究表明，TG酶對于大豆分離蛋白和小麥面筋均有一定的交聯化作用，且這種交聯化作用使得其凝膠特性、凝膠化能力更為突出；TG酶在大豆改性中可以增強大豆蛋白的凝膠特性以及相應的熱穩定性[5]；而在大豆蛋白的相應產品中，TG酶常被用作一種凝膠乳化劑以提升產品的乳化能力和膠凝程度[6]；Zhao等[7]發現，超聲輔助TG酶處理，可改善膠體的界面特性，提高乳化性和發泡性，并針對疏水間以及二硫鍵作用進行了深入研究；Hu等[8]在研究中指出，TG酶可改善蛋白質的乳化活性，引起的交聯化可以有效地提高蛋白的凝膠性狀，但乳化性的改善并不顯著，相應的乳化穩定性也有一定程度的下降；正是由于TG酶在自然界中較為常見，且天然性、可接受性、可降解性逐漸被認可，因此在食品中受到廣泛的應用，是食品工業中較為常用的酶制劑之一[9]。

目前，對于大豆、大米、花生等植物性蛋白的研究較多，但對于核桃蛋白(谷蛋白)的研究可用性以及可行性資料都較少。不能滿足實際生產的需要。核桃蛋白由谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白和球蛋白組成，其中谷蛋白與醇溶蛋白占總蛋白的70%[10]，因此使得核桃蛋白的功能性較差，不被食品工業所廣泛應用。實驗利用TG酶對核桃谷蛋白進行改性，以溶解度、巰基與二硫鍵等指標為依據，以未改性的核桃谷蛋白作對照，并結合光譜圖分析核桃谷蛋白改性前后功能特性以及蛋白分子結構表征的變化。為核桃蛋白的綜合性利用、產業化生產、高質化精深加工提供理論性參考指導。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

核桃谷蛋白(Walnut gluten，WG)；谷氨酰胺轉氨酶(100 U/g)；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、NaOH、HCl：分析純。

SENS-9003熒光光譜分析儀、TU-1810PC紫外可見分光光度計；FTIR-8400S傅里葉變換紅外光譜儀、J-810圓二色譜儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 核桃谷蛋白的制備

工藝提取流程參照Sze-Tao的Osborne分級提取法[10]：核桃餅粕→脫脂核桃粕→加去離子水→離心→沉淀→加NaCl→離心→沉淀→加70%乙醇→離心→沉淀→加NaOH調pH值→離心→上清液→加HCl調pH至等電點→離心→沉淀→水洗至中性→真空冷凍干燥→核桃谷蛋白(Walnut gluten，WG)

1.2.2 改性蛋白的制備

WG→溶解→攪拌→加酶→混勻振蕩反應→滅酶→冷卻→水洗至中性→真空冷凍干燥→TG酶改性核桃蛋白。

稱取核桃蛋白2.4 g，邊攪拌邊加入0.2 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液溶解，配成蛋白濃度為6%～8%的懸浮液；添加TG酶，200次/min振蕩反應，在反應溫度為50 ℃、反應pH值為8.0的條件下充分反應2 h后置于水浴鍋中90 ℃滅酶10 min；震蕩水浴后取出，迅速置于冰箱冷凍結冰，真空冷凍干燥機干燥24 h，即得TG酶改性蛋白(TG enzyme modified protein，TGMP)，密閉保藏。

1.2.3 溶解度的測定

根據Horax法稍作改動[11]。配制1%WG與TGMP樣液各10 mL，室溫下磁力攪拌0.5 h左右，溶液以4 500 r/min離心15 min，留取上清液待用；取空試管，加入5 mL考馬斯G-250，加入50 μL去離子水，再加入50 μL上清液，劇烈振蕩1 min左右以混勻；放置10 min，在波長595 nm處測量，對照組加入5 mL考馬斯G-250，再加入100 μL去離子水。蛋白質的溶解度表示為上清液蛋白濃度占總蛋白濃度的百分比。溶解度計算如式(1)。

(1)

1.2.4 巰基與二硫鍵測定

游離巰基含量(SH)的測定：取30 mg蛋白樣品分散于Ellman′s試劑中，使用離心機4 800 r/min離心15 min，在波長412 nm處測量。

總巰基含量(Total SH)的測定：稱取30 mg蛋白溶于10.0 mL混合試劑中(精確稱取20.84 g Tris、13.51 g甘氨酸、2.98 g EDTA二鈉和960.96 g碳酰二胺，加去離子水定容至1 000 mL)中，在波長412 nm處測量。巰基含量計算如式(6-1)。

(2)

式中：73.53 μmol/L為消光轉化系數；A412為吸光度；D為上清液稀釋(倍數)；C為上清液中蛋白含量。

二硫鍵的測定：取50 mg蛋白樣品分散于100 μL Tris-base緩沖液中，再加入到NTSB溶液中，室溫靜置1 h，使用離心機10 000 r/min離心10 min，在波長412 nm處測量，對照組加入NTSB溶液。

1.2.5 熒光分光光度分析

使用熒光分光光度計對WG與改性蛋白的三級結構進行測定。將蛋白稀釋于pH為7.0的磷酸鹽緩沖液中，使其質量濃度為0.3 mg/mL。調整激發波長為310 nm，發射波長為450 nm，選擇發射波長的測定范圍是400～500(410～460)nm。激發和發射狹縫均為5 nm，掃描速率1 200 nm/min，掃描電壓為450 mV。每個樣品重復做3次掃描[12]。

1.2.6 紫外分光光度分析

使用紫外分光光度計對WG與改性蛋白的三級結構進行測定。將WG與TGMP樣品稀釋于pH為7.0的磷酸鹽緩沖液中，使其質量濃度為0.1 mg/mL。取約5 ml樣液置于置于1 cm的石英比色皿，用分光光度計測定樣品的吸光度值，樣品的掃描波長范圍為200～400 nm[13]。

1.2.7 傅立葉紅外光譜分析

使用傅里葉紅外光譜對WG與改性蛋白的二級結構進行測定。分別稱取2 mg的WG與TGMP樣品，加入溴化鉀至200 mg(將樣品與干燥的溴化鉀以1∶100混合)，用研缽研磨成均勻粉末，壓制成薄片，使用傅立葉紅外分光光度儀在分辨率4 cm-1，波數精度0.01 cm-1上作(4 000～400 cm-1)全波段掃描，掃描32或128次，環境溫度25 ℃[14]。

1.2.8 圓二色光譜分析

使用圓二色光譜對WG與改性蛋白的二級構象進行測定。精確稱取WG樣品溶解于pH為7.0的磷酸緩沖液中，調蛋白濃度為0.3 mg/mL。在25 ℃條件下放置3 h，采用圓二色光譜儀測定WG的圓二色性。取約5 ml樣液置于2 mm石英比色皿中，選擇掃描的波長為190～250 nm，掃描速率為100 nm/min，響應溫度為25 ℃，靈敏度為100 mdeg/cm，分辨率為0.5 nm[15]。所測出的圖譜需扣除緩沖液的空白差，每個樣液重復掃描8次取平均值，蛋白的二級結構采用JASCO結構軟件進行分析，圓二色性以殘基摩爾橢圓率表示(℃·cm2/dmol)。

1.3 數據處理

每個試驗做3次重復實驗，試驗結果以誤差的形式標出。運用Excel 2003進行圖形繪制，光譜圖采用系統自帶軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 溶解度的測定分析

溶解度常被作為一種指標以此評價蛋白質的功能特性發生相對程度的改變。WG的溶解度為17.43%，而經過改性的TGMP的溶解度為：34.29%，溶解度提高了約96.75%。對于交聯化酶解產物，其最先使得氫鍵發生斷裂，其次可能作用于極性基團(—NH3+, —COO-)的數量增加，因此其溶解性會有相應的增加[16]；其次，還有可能是由于TG酶對蛋白質中的谷氨酸以及賴氨酸殘基產生交聯化，使其蛋白質分子間以及蛋白分子內部都逐漸發生了交聯化，因而所產生的蛋白質網絡空間結構發生一定變化[17]。

2.2 巰基與二硫鍵分析

巰基與二硫鍵含量對于蛋白質二級和三級空間構象的穩定有著很重要的作用，巰基與二硫鍵之間的交換作用可使得蛋白分子間發生凝聚[18]。由圖1可知，WG的游離巰基和二硫鍵含量分別為12.41 μmol/g和21.24 μmol/g，WG的大部分巰基都游離在蛋白質表面，且游離巰基的數量與總巰基的數量較為接近。TGMP的游離巰基僅有26%左右是游離在蛋白質表面，且TGMP的溶解度相比WG的溶解度有較高的提升，這可能是因為添加了TG酶，產生了TG酶的交聯改性作用，一方面促使親水性的基團逐漸分布于蛋白質表面，而疏水性的巰基基團被逐漸包埋于蛋白質內部，另一方面可能是由于其中部分的游離巰基產生斷裂，轉而與TG酶形成交聯化，導致游離巰基的數量有一定的減少。在蛋白質的空間結構中，巰基和二硫鍵是維持蛋白分子空間結構穩定以及改變一定功能特性的重要化學鍵[19]，這些化學鍵的斷裂、結合、重組，都可以使得蛋白質的更高級結構產生一定的變化，而這些變化往往又與蛋白質的功能特性緊密結合。

圖1 核桃谷蛋白與改性蛋白的巰基與二硫鍵含量

2.3 熒光光譜分析

使用熒光分光光度計對WG與TGMP進行掃描測定。蛋白質本質是由氨基酸通過肽鍵的相互連接、相互組合等方式，形成具有加大空間、較大結構性的大分子類物質。因此這種構成方式使得蛋白質分子內具有大量的基團可以被解離，而這些基團在受到外界影響時會發生一定變化，諸如氨基、羧基、羥基等，這些變化也會改變蛋白質的構成，進而影響蛋白質功能特性上的改變[20]。由圖2可以看出，在310 nm的激發波長處所產生的熒光光譜主要是由于谷蛋白中存在一定量的色氨酸所造成的，譜圖上顯示的熒光峰實質為色氨酸基團由于光激發產生的電子躍遷所導致，峰的位置在428～432 nm。

圖2 WG與TGMP的熒光光譜

TGMP的酶法改性是由于適度的酶解蛋白，使蛋白分子水解成多肽以及肽鏈，打開了蛋白質卷曲的結構，蛋白質分子逐漸展開分子鏈，蛋白質側鏈的改變影響著蛋白質三級結構的變化；由于外界環境的改變，使蛋白質由原本的折疊狀態逐漸展開呈伸展狀態，此時的蛋白質也從有序結構向無序結構轉變，發生去折疊化現象。

改變蛋白質內部結構以及蛋白質所處的微環境，都可以使蛋白質中氨基酸發生相應變化，而蛋白質分子內與蛋白質分子表面的氨基酸殘基會決定蛋白質的親水性與疏水性，親水性氨基酸會在蛋白質外部形成親水性區域，而疏水性氨基酸會在蛋白質內部形成疏水性區域。一部分色氨酸從疏水性區域游離到親水性區域，其氨基酸殘基暴露在極性環境下，從而導致其熒光強度下降；另一部分色氨酸逐漸被“包埋”于分子內部，其所處的微環境極性降低，從而也導致了熒光強度下降[21]。親水性基團的暴露，疏水基團的包埋，使得親水性極大增強，溶解度極大提高。

2.4 紫外光譜分析

目前，紫外光譜分析已成為檢測分子間相互作用以及分子結構變化的有效工具，蛋白的表面疏水性對蛋白質三級以及四級結構的變化有重要作用，蛋白的紫外吸收最為關鍵在于蛋白質側鏈上的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基，以及與一部分組氨酸和半胱氨酸基團有相關性。前三種氨基酸在蛋白中的存在以及存在的數量性直接決定了蛋白的紫外吸收強度水平，而組氨酸和半胱氨酸基團所產生的影響性以及相關性要弱于前三個氨基酸，而蛋白表面疏水性和紫外吸收的變化也反映了蛋白質構象的變化。

由圖3可知，WG的最大紫外吸收波長為284 nm，這種顯示反映了WG的紫外吸收主要是由于其蛋白內的色氨酸和酪氨酸殘基所引起的。WG的最高紫外吸收峰出現在284 nm處的0.47，而TGMP的最高紫外吸收峰出現在277 nm處的0.57；吸收度表現出略有增加，且此時TGMP的紫外吸收峰也相應出現了藍移，這都說明了色氨酸、酪氨酸等殘基基團在數量上以及所處微環境的極性狀態上均發生了改變。蛋白的紫外吸收可以反映出其內部空間構象的改變，吸光度的改變表明了蛋白結構受到了一定程度的破壞，內部的親水區域逐步暴露于蛋白分子的外部，原本暴露在蛋白外的色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸被逐漸包埋，取而代之的是更多親水性的氨基酸顯露并附在蛋白質外側，因而會增加蛋白的親水能力。

圖3 WG與TGMP的紫外光譜

2.5 紅外光譜分析

蛋白質中的二級結構通常包括：α-螺旋、β-轉角、β-折疊和無規卷曲。在酰胺Ⅰ帶上是蛋白不同二級結構信息的疊加，對譜圖可以進行線性擬合以確定出結構與峰形之間的相對應關系。在1 700～1 600 cm-1的酰胺Ⅰ帶一般是蛋白質所在的特征峰，也常用于蛋白質二級結構的分析，這主要是由于蛋白質中含有C—O鍵伸縮振動所形成的，也正是因為這樣，此處的信號較強[22]。蛋白質作為兩親性結構的代表，疏水性和親水性是決定了其乳化性的一個重要指標。

WG主要由其中的谷蛋白組成，這也使得WG對持水性的能力較差，因受到TG酶的改性作用后，改性蛋白在空間結構上受到一定程度的破壞，大量的親水性基團暴露，這也使得WG的親水性有很大的提高。對去酰胺Ⅰ帶的譜帶進行分析歸類：在1 660～1 650 cm-1為α-螺旋；在1 690～1 670 cm-1和1 640～1 610 cm-1為β-折疊；在1 700～1 690 cm-1和1 670～1 660cm-1為β-轉角；在1 650～1 640 cm-1為無規則卷曲結構[23]。

圖4 WG與TGMP的紅外光譜

2.6 圓二色光譜分析

圓二色譜常被用作定量分析植物性蛋白二級結構的組成，且可分為遠紫外和近紫外兩個區域，遠紫外區是肽鍵所在的吸收范圍，其能夠較為直觀的反映肽鏈的結構。在遠紫外光區，210 nm處的負峰顯示了具有α-螺旋結構，而α-螺旋結構過于穩定，在一定程度上會阻止蛋白的構象受到改變，蛋白質趨于穩定狀態，不利于蛋白功能特性的改變；相比α-螺旋結構，β-折疊與無規則卷曲結構使得蛋白穩定性較差，從而促使蛋白的柔性以及功能特性有良好的改變。

圖5 WG與TGMP的圓二色光譜

表1 核桃谷蛋白與改性蛋白二級結構變化的對比分析

名稱二級結構分布和含量/%α-螺旋β-折疊β-轉角無規則卷曲WG17.62±0.1135.71±0.2620.65±0.1126.02±0.05TGMP16.73±0.0836.21±0.0221.82±0.0825.24±0.05

經實驗數據分析表明，WG的二級結構主要為β-折疊，且α-螺旋結構占17.62%，平均是改性蛋白的1.05倍，β-轉角與無規則卷曲結構含量基本一樣。而TGMP的α-螺旋結構與無規則卷曲結構有一定下降，β-折疊結構與β-轉角結構有一定上升，雖然這種變化趨勢表現不明顯，但從變化趨勢以及α-螺旋結構與β-折疊結構的比值可以看出，蛋白的二級結構從一種穩定狀態趨向于另一種穩定狀態轉變。Kato等在研究中發現，蛋白分子的柔性越好，相應表現出蛋白的乳化特性越好[25]，而這種比例的改變結合溶解度的提升都表明了核桃蛋白分子柔性的轉變，改變了原本蛋白的雙親性質。

3 結論

經過TG酶改性后的蛋白溶解度提高了96.75%，這可能與氫鍵的斷裂、二硫鍵相對增多以及游離巰基相對減少有關；由總巰基與二硫鍵分析得出，蛋白的游離巰基是決定親水性的主要原因，蛋白分子內部以及分子間化學鍵的變化，都可以引發蛋白相對高級結構的變化，而結表征性的變化又會影響到蛋白外在的功能特性。

由熒光光譜分析得出，吸收峰出現了藍移現象，說明當內部的色氨酸與外部的環境(pH、溫度等)發生改變時，蛋白質的高級結構也會發生相應的改變。通過熒光強度的被影響可知，蛋白的親水性以及疏水性發生了一定的變化；由紫外光譜分析得出，蛋白的最大紫外吸收波長在284 nm處，說明了吸收主要來自分子內部的色氨酸和酪氨酸殘基，且吸收峰出現了紅移現象，這間接表明了氨基酸的極性狀態發生了一定改變；由紅外光譜分析得出，蛋白在受到改性后，其疏水性的基團逐漸減少，而親水性的基團逐漸增多；由圓二色光譜分析得出，α-螺旋結構有較為明顯的下降，β-折疊結構有一定的上升，α-螺旋與β-折疊的比例也表明了蛋白二級結構的變化；圓二色譜中蛋白二級結構的分布也證明了WG與TGMP在分子結構上的變化，WG更偏重于α-螺旋結構，而TGMP則更偏重于β-折疊與β-轉角結構。