枯草芽孢桿菌發酵制備玉米肽-葡萄糖螯合物的條件優化

劉 奇 張 智

(東北林業大學林學院，哈爾濱 150040)

目前我國玉米主要用于工業發酵制備酒精、生產玉米糖漿和淀粉。玉米在深加工生產玉米淀粉時會產生大量的副產物——玉米蛋白，該副產物硬度高、水溶性差，因此常被做為飼料廉價銷售或丟棄，浪費資源的同時造成環境的污染[1]。

玉米肽是一種由玉米蛋白經水解后，通過肽鍵將氨基酸以不同的排列方式連接而成的具有特定空間結構的生物功能活性的短肽聚合物[2-3]。研究表明玉米肽具有抑制血管緊張素轉換酶[4]、降低血壓[5]、促進乙醇代謝、醒酒護肝[6]以及抗氧化[7-12]、緩解疲勞[13]、抗癌[14]等功能。越來越多的植物蛋白肽被廣泛應用于幼兒輔食、功能保健食品中[15-21]。

常用的制備玉米活性肽的方法有酶解法、微生物發酵法和化學合成法[22]。微生物發酵法制備玉米肽可降低肽的苦味和抗營養因子，簡化生產工藝的同時降低生產成本[23]等特點。螯合是一種高新技術，玉米肽-葡萄糖螯合物是通過微生物發酵產生的胞外酶將葡萄糖鑲嵌在兩個肽分子之間的一種穩定的連接形式，在提高肽穩定性的同時，提高其功能活性和適口性。張智[24]等利用玉米肽與鋅、香菇多糖鍵合制備玉米肽與鋅、香菇多糖的螯合物，發現該螯合物能顯著(P<0.05)提高小鼠的非特異性免疫等功能，但由于鋅、香菇多糖的成本相對較高，若能利用微生物發酵法將玉米肽與成本相對較低的葡萄糖螯合，制成功能活性肽應用于新資源食品領域的開發中，既可改善產品的適口性、提高玉米肽的化學穩定性及生物學效價，又可在節約資源的同時提高玉米副產物的附加值，實現糧食作物長久可持續發展。

本研究以玉米肽和葡萄糖為底物，通過單因素及響應面優化實驗得出微生物發酵(枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ls-45)制備玉米肽-葡萄糖螯合物的最優條件，為后續研究玉米肽-葡萄糖螯合物體內、體外抗氧化活性提供數據支持，為產業化生產玉米肽系列功能產品提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

種子培養基:葡萄糖0.5%、酵母膏1%、蛋白胨0.5%、氯化鈉0.2%。

玉米肽；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ls-45；蛋白胨；酵母膏；葡萄糖；DPPH。

1.2 儀器與設備

722S可見分光光度計；TU-1810紫外分光光度計；5030-PVL程控壓力蒸汽滅菌器；SW―CJ―IFD超凈臺；AR2140型分析天平；S220型pH計；ZD-85雙功能氣浴恒溫振蕩器。

1.3 試驗方法

1.3.1 玉米肽-葡萄糖螯合物制備方法

將玉米肽(通過Sephadex G-25分級得到肽段(平均分子質量為572 u，肽含量為75.83%))配制成底物濃度為4%的溶液，調節pH值至7；取50 mL玉米肽溶液，按投料比為8∶1的比例加入葡萄糖供體，再次調節pH值至7；121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻至室溫；在無菌條件下接入枯草芽孢桿菌菌液進行發酵；得到的發酵液再次滅菌，冷卻后4 500 r/min離心10 min；流水透析24 h，過濾后冷凍干燥得到最終玉米肽-葡萄糖螯合物。組分中玉米肽及葡萄糖的含量相對較高，所占比例為80.05%；玉米肽-葡萄糖螯合率為69.58%。

1.3.2 DPPH清除率的計算

將玉米肽-葡萄糖螯合物配制成3 mg/mL的樣液備用，用95%的乙醇溶解DPPH粉末，配成0.2 mmoL/L的DPPH溶液。取待測樣品溶液和DPPH各2 mL混勻，室溫下避光放置30 min后，于517 nm處測吸光度值，記為OD1；對照組用95%的乙醇代替DPPH溶液，同樣條件下室溫下避光放置30 min后，于517 nm處測吸光度值，記為OD2；空白組用蒸餾水代替樣液，于517 nm處測定吸光值，記為OD0。

(1)

式中：OD1為樣液加DPPH溶液的吸光度值；OD2為樣液加乙醇溶液的吸光度值；OD0為乙醇加DPPH溶液的吸光度值。

1.3.3 單因素試驗優化玉米肽-葡萄糖螯合條件

以接種量、發酵時間、發酵溫度、pH 4個因素研究不同發酵條件對玉米肽-葡萄糖螯合DPPH清除率的影響，并分別進行單因素試驗。

1.3.3.1 接種量對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響

接種量分別為4%、6%、8%、10%、12%和14%，發酵時間48 h，發酵溫度30 ℃，發酵液pH值6，搖床轉速120 r/min，其余過程采用1.3.1玉米肽-葡萄糖螯合物制備方法，考察接種量對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響。

1.3.3.2 發酵時間對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響

選取發酵時間分別為24、36、48、60、72、84 h，發酵溫度30 ℃，發酵液pH值6，搖床轉速120 r/min，枯草芽孢桿菌接種量12%，其余過程采用1.3.1玉米肽-葡萄糖螯合物制備方法，考察時間對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響。

1.3.3.3 發酵溫度對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響

選取發酵溫度分別為25、30、35、40、45、50 ℃，枯草芽孢桿菌接種量12%，發酵時間48 h，發酵液pH值6，搖床轉速120 r/min，其余過程采用1.3.1玉米肽-葡萄糖螯合物制備方法，考察溫度對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響。

1.3.2.4 pH對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響

選取pH值分別為5、5.5、6、6.5、7和7.5，枯草芽孢桿菌接種量12%，發酵溫度30 ℃，發酵時間48 h，搖床轉速120 r/min，其余過程采用1.3.1玉米肽-葡萄糖螯合物制備方法，考察pH對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響。

1.3.4 響應面優化試驗

根據單因素試驗結果，通過Design Expert 8.0.6軟件，Box-Behnken實驗設計原理，針對接種量、發酵時間、發酵溫度和pH進一步設計四因素三水平的響應面優化試驗，以DPPH清除率為指標，從而得出發酵最優條件。

表1 響應面分析試驗因素與水平

1.3.5 數據分析

采用SPSS軟件對數據統計分析，用Excel軟件進行繪圖處理。

2 結果分析與討論

2.1 單因素條件確定

由圖1接種量對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響可知，接種量從4%增加至10%時，DPPH清除率也隨之從4.60%增加到38.00%，這可能由于接種量增加，枯草芽孢桿菌的發酵作用使玉米肽能更充分地與葡萄糖結合，形成具有功能活性的玉米肽-葡萄糖螯合物。當接種量從10%增加至14%，清除率又開始下降，這可能是由于底物濃度一定，隨著接種量的增加，底物逐漸被消耗的同時也使得所合成的玉米肽-葡萄糖螯合物被消耗，故其DPPH清除率呈下降趨勢。

圖1 接種量、發酵時間、發酵溫度、pH值對DPPH清除率的影響

由pH對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響可知，在pH 5到pH 6之間，玉米肽-葡萄糖螯合物玉米肽-葡萄糖螯合物的DPPH清除率逐漸升高，在pH為6時DPPH清除率達到最大83.08%。而從pH 6到pH 7.5，DPPH清除率開始呈減小趨勢。在pH<6時供體DPPH清除率隨pH增大而逐漸升高，說明在偏酸性環境下，玉米肽-葡萄糖螯合物抗氧化能力較好。

由發酵時間對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響可以看出隨發酵時間的延長，玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率呈先升高后降低的趨勢。發酵48 h時玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率從35.38%升高到80.47%。發酵48 h到84 h，隨發酵時間延長玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率反而降低。這是由于在葡萄糖和玉米肽底物一定的情況下，隨發酵時間延長，枯草芽孢桿菌將底物消耗的同時，也消耗了部分玉米肽-葡萄糖螯合物導致其DPPH清除率降低，因此后續實驗選擇發酵48 h為一個周期。

由發酵溫度對玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率的影響可知，發酵溫度在25～35 ℃時玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率隨發酵溫度升高而升高，35～50 ℃時隨發酵溫度升高，供體DPPH清除率降低，當溫度為35 ℃時DPPH清除率最高。由此可知35 ℃為枯草芽孢桿菌發酵的最適溫度。溫度從35 ℃變化至50 ℃，玉米肽-葡萄糖螯合物DPPH清除率隨溫度升高而降低，其原因可能為溫度過高破壞了酶活，同時使玉米肽的結構發生一定程度的變化，功能肽段部分被破壞甚至水解，無法發揮其作用。

2.2 響應面試驗設計結果與分析

2.2.1 響應面試驗設計及結果

采用四因素三水平的響應面優化試驗考察接種量、發酵時間、發酵溫度和pH對玉米肽-葡萄糖螯合物的影響，結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計及結果

如表2所示，采用Box-Be hnken模型，進行四因素三水平響應面分析試驗，試驗設計29個試驗點，其中4個因子分別為A接種量(%)、B發酵時間(h)、C pH、D發酵溫度( ℃)，以玉米肽-葡萄糖螯合物的DPPH清除率作為響應值。

微生物法修飾玉米肽的回歸方程為：

y=+90.35+1.04A-0.54B+0.36C+1.86D+0.34AB-0.33AC-0.47AD+0.24BC-0.80BD+0.41CD-2.86A2-3.76B2-4.51C2-2.54D2

公式中y為響應值，A、B、C、D分別為對應的響應值。由公式可以看出擬合出的回歸方程的二次項系數均為負數，因此實驗中建立的模型的拋物面開口是向下的，即響應值存在最大值。

2.2.2 回歸方程的方差分析

應用軟件Design-Expert 8.0.6，根據中心響應面實驗原理對表3中DPPH清除率數據處理，方差分析結果如表3。

表3 回歸模型方差分析表

注:P<0.01，極顯著，**；P<0.05，顯著，*。

由表3可以看出P<0.000 1表明該模型極顯著，R2為97.12%，調整R2為96.96%，說明擬合的方程較好。通過F值看出，試驗中各因素對DPPH清除率的影響大小順序為：D>A>B>C，即發酵溫度>接種量>發酵時間>pH。所有二次項差異顯著，其他項不顯著。利用響應面法優化枯草芽孢桿菌發酵玉米肽-葡萄糖螯合物條件為：接種量10.28%，發酵時間46.80 h，pH 6.05，發酵溫度36.85 ℃，此時DPPH清除率理論值為90.34%。

2.2.3 驗證實驗

從實際操作的角度考慮，驗證實驗選取的發酵條件為接種量10%，發酵時間46 h，pH 6，發酵溫度37 ℃，該條件下實測值為90.82%，與理論值相差0.48%，故此條件為發酵的最佳工藝條件。

3 結論

通過單因素及響應面優化實驗得出枯草芽孢桿菌優化玉米肽-葡萄糖螯合物的最優發酵條件為接種量10%，發酵時間46 h，pH 6，發酵溫度37 ℃，此時DPPH清除率為90.82%。此研究彌補了利用微生物發酵法制備玉米肽-葡萄糖螯合物的空缺，提高玉米加工副產物附加值的同時，為后續研究該玉米肽-葡萄糖螯合物體內、體外抗氧化及細胞實驗提供數據支持。