一株單寧降解菌的鑒定及其對青海“雙低”菜籽粕中單寧降解效果

丁 棟 李錦麗 李長忠 雷占靜 楊豐年

(青海大學生態環境工程學院1，西寧 810016) (中國科學院鹽湖資源綜合高效利用重點實驗室；青海省鹽湖資源化學重點實驗室2，西寧 810008)

當飼料中菜籽粕含量過高時，菜籽粕中以單寧為主的抗營養因子會產生影響適口性、在動物腸胃中產生不溶性化合物、導致腸胃中消化酶活性喪失、因沉淀作用降低礦物元素利用率等負面影響，造成動物生長及飼料利用率顯著下降，從而增加飼料投入成本[1-2]。研究有效的菜籽粕中單寧的處理方法，對于合理利用 “雙低”菜籽粕飼料原料具有重要的研究價值及意義。

針對植物性飼料中單寧的處理方法主要包括物理處理法、化學處理法及生物處理法。其中生物處理是經濟、環保的處理方法之一。當前，對單寧生物處理研究內容主要包括兩個方面：一方面，自土壤、植物、食品、廢水、食物材料加工設備及廢水處理設備等特殊生境，針對水解單寧的酯鍵及羧酸鍵，篩選高效單寧降解菌，如Escherichiacoli，AspergillusnigerHA37，Paecilomycesvarioti[3-4]。另一方面，以單寧降解菌為基礎，優化單寧降解體系，包括：單寧降解菌產生優質單寧酶的篩選及結構鑒定，單寧酶固定化處理，產單寧酶微生物發酵培養體系優化及優質單寧酶的生物合成等[5-8]。

微生物固態發酵法是簡易有效的單寧降解方法之一，相關微生物資源的篩選是該方法的核心研究內容。研究表明，青海典型生境中微生物資源具有特殊的研究意義及價值[9]，但是與該地區單寧降解菌相關的研究內容鮮見報道。因此，篩選青海典型生境中有效單寧降解菌資源，不僅擴充相關菌種資源庫，也為青海典型生境中微生物資源的應用提供參考。同時，青海具有典型高原大陸性氣候，作物病蟲害少，耕地土壤污染小等特點，現已成為北方春油菜及南方弱冬性油菜種植區繁種、制種的重要基地，油菜種植面積及產量逐年增加[10-11]。青海“雙低”菜籽粕是青海省研發的“雙低”油菜籽加工后生成的農副產品，其蛋白、礦物元素及微量元素含量高，成本投入低，是具有開發價值的飼料原材料。

本實驗對青海地區可培養單寧降解菌資源進行篩選及鑒定，并以青海“雙低”菜籽粕為研究對象，進行固態發酵處理應用研究，以期為青海地區微生物資源應用提供科學數據，同時也為有效處理“雙低”菜籽粕中單寧，合理利用青海“雙低”菜籽粕提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

土壤樣品采集時間為2018年7月，采樣點位于青海省門源縣(E101°29′51″, N37°22′51.7″, 海拔2 867 m)。根據樣地植被覆蓋度及多樣性評估結果，將樣地分為高、中、低三等級。針對三種等級植被樣地，采用樣方采樣法(樣方面積為1 m×1 m)，采集樣方邊角及中心0～20 cm土層樣品，分裝入無菌自封袋中備用。

1.2 土壤樣品預處理

稱取土壤樣品10 g，室溫風干。取風干土樣于無菌研缽中，去除植物根系等雜質，烘箱100 ℃條件處理20 min。稱取1 g處理土壤樣品于100 mL無菌蒸餾水中，135 rpm/min、27 ℃條件下振蕩處理30 min，土壤懸液靜置備用。

1.3 菌種的分離、純化、篩選及鑒定

1.3.1 培養基

菌種分離培養基為黃豆培養基：黃豆粉1.5 g，葡萄糖0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，K2HPO40.1 g，KH2PO40.1 g，MgSO40.03 g，FeSO4·7H2O 0.002 g，ZnSO40.002 g，瓊脂1.5 g，H2O 100 mL，pH 7.2～7.4；菌種篩選培養基：蛋白胨1 g，牛肉膏0.3 g，NaCl 0.5 g，1%單寧(0.22 μm濾器過濾除菌)，瓊脂1.5 g，H2O 100 mL，pH 7.0。

1.3.2 菌種分離、純化及篩選

梯度稀釋法[12]處理土壤懸液。吸取10-3稀釋液10 μL至黃豆平板培養基表面，涂布平板法[12]處理菌液，27 ℃恒溫倒置培養，平板劃線法[21]純化培養菌體。純化菌種選擇菌種篩選培養基通過平板篩選法篩選[13]。

1.3.3 菌種掃描電鏡檢測

液體發酵目標菌種100 mL，無菌水清洗菌體，3 000 r/min離心5 min收集菌體沉淀。菌體沉淀中加入40倍體積2.5%戊二醛，混勻后靜置固定2 h。無菌水清洗固定菌株，分別加入30%、50%、70%、80%及90%乙醇靜置脫水10 min，3 000 r/min離心5 min收集菌體沉淀，無菌水重懸菌體。吸取適量處理菌液置于裝片臺上，37 ℃烘干處理，JSM-5610LV掃描電鏡檢測。

1.3.4 菌種鑒定

菌種生理生化特征檢測參照《伯杰細菌系統鑒定手冊》(第9版)及《常見細菌系統鑒定手冊》[14-15]。菌株16S rRNA擴增選用EmeraldAmpTMPCR Master Mix Kit(Sangon Biotech，Shanghai)，擴增引物為27F(5’-AGAGTTTGATC (A/C)T G G C T C AG-3’)及1492R(5’-TAC G G (C/T)TACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，反應30個循環；72 ℃再延伸10 min。選用DiaSpin DNA Gel Extraction Kit(Sangon Biotech，Shanghai)回收擴增產物，通過pUCm-T Vector PCR Products Cloning Kit(Sangon Biotech，Shanghai)構建16S rRNA基因克隆文庫，篩選陽性克隆子10株送至生工生物工程上海有限公司測序。DNAMAN 9.0處理測定克隆子序列，處理結果通過NCBI數據庫 Blast比對，并用Clustal W以及MEGA 7.0軟件中鄰接法構建與序列相似菌種16S rRNA系統發育樹[16]。

1.4 菌種固態發酵處理青海“雙低”菜籽粕作用效果研究

1.4.1 單寧標準曲線制作

選用FeCl3顯色法構建單寧標準曲線。顯色劑配制：0.01 mol/L FeCl3溶液溶解于0.01 mol/L HCl中備用。單寧標準液配制：無菌蒸餾水溶解單寧，終濃度定容至1%(g/100 mL)，選用0.22 μm濾器過濾單寧溶液除菌備用。單寧標準曲線制作：反應液總體積為6 mL，分別取已配制單寧液0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL，室溫條件下與顯色劑反應30 min，測定吸光值(A530 nm)，實驗重復3次。最終以單寧液體積為橫坐標，吸光值(A530 nm)為縱坐標，構建單寧標準曲線。

1.4.2 料液比對固態發酵處理效果的影響研究

60目篩網篩選青海“雙低”菜籽粕5 g，高溫高壓滅菌處理備用。目標菌種液體發酵至濃度為108個/mL，接種發酵液1 mL至含水量為50%、100%、150%、200%、250%菜籽粕固態培養基中，以接種1 mL無菌水菜籽粕固態培養基為空白對照，室溫發酵處理5 d。樣品發酵后，凍干處理并用1 mL無菌水溶解，0.45 μm濾器過濾，FeCl3顯色法檢測單寧含量，每一處理設立平行實驗5次。

1.4.3 溫度對固態發酵處理效果的影響研究

菜籽粕篩選及處理同1.4.2。目標菌種液體發酵至濃度為108個/mL，接種發酵液1 mL至100%料液比菜籽粕固態培養基中，以接種1 mL無菌水菜籽粕固態培養基為空白對照，以15、25、35、45、55 ℃溫度條件發酵處理5 d。發酵結果處理同1.4.2。

1.4.4 時間對固態發酵處理效果的影響研究

菜籽粕篩選及處理同1.4.2。目標菌種液體發酵至濃度為108個/mL，接種發酵液1 mL至100%料液比菜籽粕固態培養基中，以接種1 mL無菌水菜籽粕固態培養基為空白對照，在室溫條件下分別發酵處理1、2、3、4、5 d。發酵結果處理同1.4.2。

1.4.5 數據處理

結合單寧標準曲線，計算不同實驗處理單寧降解率，SPSS 22.0完成差異顯著性分析(P<0.05)，Graphpad prism 5.0制圖。單寧降解率計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 單寧降解菌DT-3的形態特征

研究采用梯度稀釋法自青海門源高寒草甸土壤分離菌種，根據菌種顏色、形態及大小等表觀特征對初步分離菌群進行純化，最終獲得單菌落菌株123株。通過平板篩選法篩選到單寧降解菌1株，初步命名為DT-3。菌落在分離培養基表面特征為直徑2 mm，表面形態呈黃色、圓形、凸起、不透明、光滑濕潤且邊緣整齊，在篩選培養基上呈現棕綠色水解圈(圖1a、圖1b)。掃描電鏡顯示菌株為桿狀，無鞭毛或其他細胞外結構，長度4 μm(圖1c)。

圖1 DT-3的水解及菌體特征圖

2.2 單寧降解菌DT-3的生理生化特征

對單寧降解菌DT-3生化特征及碳水化合物發酵等24項內容進行檢測，結果表明菌種DT-3在檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原反應、脲酶檢測及β-半乳糖甘酶活性檢測中呈陽性，對葡萄糖利用呈陽性(表1)。

表1 菌種DT-3生化特征及碳水化合物發酵檢測

注:“+”表示實驗結果為陽性；“-”表示實驗結果為陰性。

2.3 單寧降解菌DT-3 16S rRNA鑒定

菌種DT-3采用液氮凍融法提取總DNA，PCR擴增獲得大小約1 500 bp 16S rRNA基因序列。構建目的基因克隆文庫，隨機挑選陽性克隆子10株完成序列測定。測序結果通過DNAMAN 9.0進行多重序列間比對，一致性等于99.8%，表明擴增基因純度及測序結果良好。NCBI比對基因序列，結果與菌種Pseudoxanthomonasdaejeonensis序列相似性達97%，結合形態及電鏡特征，最終將菌種DT-3命名為Pseudoxanthomonassp. DT-3。測定序列提交至NCBI GenBank，獲取基因序列號MK 418539(圖2)。

圖2 根據鄰接法構建DT-3 16S rRNA基因序列系統發育樹

2.4 菌種DT-3固態發酵處理青海“雙低”菜籽粕作用效果研究

2.4.1 單寧標準曲線構建

選用FeCl3顯色法構建單寧標準曲線。以相同濃度、不同體積單寧液為橫坐標，吸光值(A530 nm)為縱坐標，通過Graphpad prism 5.0軟件構建單寧標準曲線圖。最終構建標準曲線線性回歸方程為Y=0.007 7X+0.010 7(R2=0.992 6)。依照單寧標準曲線(圖3a)及降解率公式計算處理后單寧含量及降解率。

2.4.2 料液比對固態發酵處理效果的影響

通過SPSS 22.0對不同料液比處理條件下單寧降解效果進行差異顯著性分析(P<0.05)，研究結果表明(表2，圖3b)：對60目過篩處理菜籽粕，經固態發酵5 d，菌種DT-3對含水量分別為50%、100%、150%、200%、250%菜籽粕中單寧的降解效果差異顯著。不同含水量處理條件，降解率由高到低排序為100%>150%>200%>250%>50%。含水量為100%時，菜籽粕中單寧降解率最大，為58.8%，與其他處理條件相比差異極顯著。含水量為50%時，菜籽粕中單寧降解率最小，為37.41%，相比含水量250%處理條件降解效果差異顯著，與其他處理條件相比差異極顯著。

2.4.3 發酵溫度對固態發酵處理效果的影響

通過SPSS 22.0對不同發酵溫度處理條件下單寧降解效果進行差異顯著性分析(P<0.05)，研究結果表明(表2、圖3c)：對60目過篩處理菜籽粕，料液比為100%，菌種DT-3在發酵溫度分別為15、25、35、45、55 ℃條件下，固態發酵處理5 d后，菜籽粕中單寧降解效果差異顯著。不同發酵溫度，降解率由高到低排序為25>35>45>15>55 ℃。發酵溫度為25 ℃時，菜籽粕中單寧降解率最大，為62.95%，與其他處理條件相比差異極顯著。發酵溫度為55 ℃時，菜籽粕中單寧降解率最小，為0.17%，相比15 ℃處理效果差異顯著，與其他處理條件相比差異極顯著。

2.4.4 發酵時間對固態發酵處理效果的影響

通過SPSS 22.0對不同發酵時間處理條件下單寧降解效果進行差異顯著性分析(P<0.05)，研究結果表明(表2，圖3d)：根據降解率高低，菌種DT-3對60目過篩處理菜籽粕，料液比為100%，不同發酵時間降解率依次為5>4>3>2>1 d。其中固態發酵菜籽粕5 d時，降解率最高，為61.74%，相比發酵4 d的處理效果差異不顯著，但與其他發酵處理時間降解效果相比差異極顯著。發酵處理1 d時，菜籽粕中單寧降解率最小，為38.81%，相比其他條件處理效果差異極顯著。發酵處理3 d及4 d時，降解效果差異顯著。

圖3 單寧標準曲線(A)及不同條件下DT-3發酵處理效果(B、C、D)

處理因素處理條件單寧含量(平均值±標準誤)/mg/mL降解率/%顯著性?α=0.05α=0.01505.67±0.0437.41aA1003.73±0.0258.80eD料液比 /%1503.96±0.0456.26dC2004.75±0.0447.56cB2505.54±0.0738.81bA

續表2

注:標記字母說明顯著性分析結果。

3 討論

生物脫毒法是去除飼料中抗營養因子經濟環保的處理方法之一，其處理方式包括添加酶制劑法及微生物發酵法，即向飼料中添加外在酶系或微生物，經發酵處理，去除飼料中的抗營養因子。相比而言，添加酶制劑法要求較高，影響處理效果的因素較多，如酶活性、酶的穩定性、最優酶活性條件、酶的固定處理等。而微生物發酵法要求較低，影響因素較少，如微生物對飼料主要營養成分有無吸收利用，菌種有無毒性代謝物生成，菌種是否影響飼料適口性等，因此微生物發酵法較為簡易。

篩選微生物資源是微生物發酵法的核心內容。當前，針對單寧降解菌篩選及降解效果的研究內容廣泛，篩選出單寧降解特性的菌種包括Penicilliumpurpurogenum、Paecilomycesvarioti、Aspergillusheteromorphus、Streptomycessviceus、Aspergillusniger等[17-21]。針對普通“雙低”菜籽粕單寧降解效果研究，以黑曲霉降解效果最佳，降解率達到90%[22]。青海獨特的生態環境賦予該地區微生物資源以特殊的研究意義及價值，目前針對該地區抗營養因子降解菌的篩選研究鮮見報道。本研究自青海門源高寒草甸生境中篩選到菌種123株，通過平板法篩選到單寧降解菌1株，通過形態特征、生理生化檢測及16S rRNA序列測定，將該菌定名為Pseudoxanthomonassp. DT-3 (MK 418539)，菌種屬于假黃單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)。研究表明，假黃單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)生物降解能力具有重要的研究價值：Giri等[23]自除草劑處理麥田中分離到一株異丙隆降解菌(Pseudoxanthomonassp.)，并對菌種的異丙隆降解效能進行研究，發現該菌種對異丙隆除草劑的降解效率達(165.73±0.59) mg L-1；Du等[24]自中國不同棲息地分離篩選產纖維素乙醇降解菌，并對菌種降解作用的重要性進行了研究，發現Pseudoxanthomonastaiwanensis在降解纖維素并產纖維素乙醇過程中扮演了主要角色；Wang等[25]自雙氯苯基三氯乙烷(DDT)污染土壤中分離到一株DDT降解菌株，通過菌種鑒定將該菌株命名為Pseudoxanthomonasjiangsuensissp.nov.。本研究對青海門源高寒草甸土壤中分離得到的一株單寧降解菌Pseudoxanthomonassp. DT-3 (MK 418539)的特征及其單寧降解特性進行報道，研究結論為假黃單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)的生物降解應用增加相關理論數據。

研究表明，飼料中單寧含量在主要成分中占比超過0.5%，即顯著影響飼料蛋白質及礦物元素利用率[26-27]。青海“雙低”菜籽粕中單寧含量約占主要成分0.52%，質量占比約為0.18%，鑒于此，本實驗對“雙低”菜籽粕進行DT-3固態發酵法處理單寧效果進行研究，60目過篩處理飼料，最適于微生物對飼料的發酵處理，因此選擇60目過篩為飼料的初步處理條件。結合菌種生長特性，對不同發酵溫度、料液比及發酵時間的降解效果進行了研究。結果表明料液比為100%、發酵溫度為25 ℃、發酵天數為5 d時單寧降解率最大，分別達到58.8%、62.95%及61.74%，對青海“雙低”菜籽粕中的單寧降解效果良好。研究結果也間接說明了菌種DT-3發酵處理過程中，保證微生物生長活性的最佳水活度、生長溫度及生長時間。

4 結論

對青海地區單寧降解菌進行篩選、鑒定及固態發酵處理效果研究，為相關的研究方向提供了重要的基礎數據。通過對菌種固態發酵條件優化處理，單寧降解率最高為62.95%，相比黑曲霉降解效果較低。今后將對DT-3中單寧降解基因的篩選與表達，DT-3代謝物及其對菜籽粕中營養物質的影響，發酵產品適口性等內容做進一步研究，從而為提高菌種DT-3單寧降解效率、開發相關菌種資源及其作為飼料添加劑的價值評估夯實理論基礎。