轉mapk雙鏈RNA 表達載體黃瓜對土壤線蟲多樣性的影響

趙曉曼 趙松宇 孫婷婷 田雪亮* 弭寶彬

（1 河南科技學院資源與環境學院，河南新鄉 453003；2 湖南省農業科學院蔬菜研究所，湖南長沙 410125）

據統計，1996 年全球轉基因農作物種植面積為170 萬hm2，到2000 年增至4 420 萬hm2，2016年全球轉基因作物種植面積就達1.851 億hm2，比1996 年增加了110 倍。2016 年耐除草劑作物種植面積為8 650 萬hm2，約占全球轉基因作物種植面積的47%，抗蟲轉基因作物約占12%（Clive，2016）。隨著轉基因作物大面積種植，人們對轉基因作物的農業生態環境和人類健康的潛在安全性問題日益關注（劉迎哲，2017；黃錦華 等，2018），開展了眾多研究。目前，大量研究集中在轉Bt 蛋白基因作物的環境安全性，也就是轉基因作物對天敵昆蟲和土壤微生物的影響，如細菌、真菌、土壤線蟲等（陳彥君，2017；梁晉剛和張秀杰，2017；邱良妙 等，2018；周霞 等，2018）。土壤線蟲種類多樣，數量豐富，廣泛分布于各類土壤中，是土壤生物中十分重要的類群。據估計目前已知土壤線蟲數量占地球線蟲總數量的35%（Andrassy，1992），它們在土壤生態系統中占有多個營養級，與其他土壤生物構成食物網，對土壤物質循環和能量流動起著重要的作用，因此土壤線蟲在指示土壤食物網總體情況及土壤生態功能方面具備較強的優勢（Bongers，1990），在評價轉基因作物環境安全性方面也被廣泛應用。Griffiths 等（2005）研究發現，轉Bt基因玉米土壤線蟲數量與親本玉米相比表現出顯著的短暫降低。李修強等（2012）研究發現，轉Bt基因水稻土壤線蟲數量與親本相比無明顯差異。風春等（2015）研究發現，轉Bt基因棉花對土壤線蟲群落結構和種類組成的影響不顯著。上述研究主要針對轉Bt基因作物對土壤線蟲的安全性進行評價，而對其他類型的轉基因作物安全性的研究較少。

促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein，MAPK）廣泛存在于真核生物中，是一類高度保守的信號轉導路徑，在病原物誘導的抗病反應中發揮著重要的作用（馬曼莉，2018）。根結線蟲是嚴重危害番茄、黃瓜等蔬菜作物的土傳性病害，其防治方法包括抗性品種利用、化學防控、物理防控及生物防控等。轉mapk雙鏈RNA表達載體黃瓜能夠抑制根結線蟲對黃瓜根系的侵染，對土壤真菌、古菌、細菌未產生顯著影響（陳國華 等，2013；弭寶彬 等，2013；弭寶彬，2013）。但轉mapk雙鏈RNA 表達載體作用靶標為根結線蟲的MAPK 激酶，而土壤線蟲也存在類似基因，轉mapk基因是否對土壤線蟲具有影響有待研究。

鑒于此，本試驗以轉mapk雙鏈RNA 表達載體黃瓜為對象，分析轉基因黃瓜對土壤線蟲多樣性的影響，以期為評價轉基因黃瓜的生態安全性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地點及供試材料

試驗田位于北京順義溫室基地。轉基因黃瓜材料來自中國農業科學院蔬菜花卉研究所，含有Mi mpk1基因片段的雙鏈RNA 表達載體。該基因片段來自南方根結線蟲，GenBank 登錄號為DQ923592。以非轉基因黃瓜（Cucumis sativusL.）材料（品種代號9930）為對照。轉基因黃瓜和非轉基因黃瓜材料在同一溫室連續種植3 a（2015～2018年），每年種植兩茬，春茬黃瓜生長期為4～6 月；秋茬黃瓜生長期為8～10 月。轉基因黃瓜和非轉基因黃瓜材料按壟間隔種植，各材料種植50 壟，每壟40 株，兩種材料的種植面積分別為200 m2。每種材料3 次重復。黃瓜生長期間按正常農事操作管理。為了防止轉基因材料擴散，溫室設置防蟲網，專人管理。

1.2 土壤取樣方法

于第3 年6 月中旬取黃瓜根際土壤樣品，轉基因黃瓜和非轉基因黃瓜材料分別選5 壟作為5 個取樣點。每個取樣點選擇10 株黃瓜，用土壤采樣器采集距離根部5 cm 處土壤，取樣深度 0～15 cm。10 株黃瓜根際土壤混入一個密封袋，作為一個樣點的土壤樣品。每個材料共計取5 個樣點，即5 次重復，帶回實驗室，分離土壤線蟲。

1.3 土壤線蟲收集

土壤線蟲收集采用淺盤法：將塑料筐放入平底托盤，單層面巾紙平鋪于塑料筐底。稱取200 g 土壤樣品置于面巾紙上，在平底托盤中加入自來水，確保水面浸沒土壤，靜置過夜16 h 以上，然后收集平底托盤水中的土壤線蟲，離心棄上清液，富集土壤線蟲后置于4 ℃冰箱保存。

1.4 土壤線蟲DNA 的提取

為了排除土壤腐殖酸對下游試驗的影響，采用土壤微生物DNA 提取試劑盒（MP Biomedicals FastDNA kit，American）提取土壤線蟲DNA，具體流程參考說明書。提取的土壤線蟲DNA 經檢測合格后，保存于-20 ℃ 冰箱。

1.5 線蟲18S rDNA 基因克隆文庫構建

以18S rDNA 基因片段作為土壤線蟲的marker 基因，引物為MN18F（5′-CGCG AATRGCTCATTACAACAGC-3′）和22R（5′-GCCT GCTGCCTTCCTTGGA-3′）（Waite et al.，2003），目的片段約900 bp。PCR 反應體系25 μL：1.5 μL DNA 模板，1 μmol·L-1上下游引物，0.5 mmol·L-1dNTPs，2 μL EasyTaqDNA 聚合酶、1×反應緩沖液，20 μL ddH2O。PCR 程序：95 ℃預變性4 min；95 ℃ 變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環；72 ℃ 延伸5 min。PCR 產物經電泳檢測，純化，連接入pEASY-T5 載體（北京百邁克生物技術有限公司），轉化Trans5α 感受態細胞（北京百邁克生物技術有限公司），涂布LB 平板（氨芐青霉素50 μg·mL-1），過夜后隨機挑取200 個陽性克隆培養于LB 液體培養基（氨芐青霉素50 μg·mL-1）中振蕩培養8 h，將克隆送北京六合華大基因科技有限公司測序。轉基因黃瓜和非轉基因黃瓜根際土壤線蟲各構建3 個文庫。

1.6 數據分析

采用Chimera Check 軟件對土壤線蟲18S rDNA 基因序列進行過濾去雜，去除嵌合體序列。用DOTUR 軟件包對土壤線蟲18S rDNA 序列劃分操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），設定閾值為97%。將每個OTU 代表序列在NCBI進行BLAST 比對，鑒定土壤線蟲的物種信息。依據各線蟲比例，計算Shannon 和Simpson 指數（海棠 等，2008）。

Shannon 指數H=-∑PilnPi

Simpson 指數D=1-∑Pi2

Pi是樣本中第i個線蟲分類單元個體數占土壤線蟲分類單元總體數量的比例。土壤線蟲種類數目是描述土壤線蟲群落的重要指標，文庫OTU 數目（S）代表土壤線蟲種類數目。

為了分析轉基因黃瓜和非轉基因黃瓜根際土壤線蟲群落的差異，采用SPSS 軟件對Shannon、Simpson 指數和S 進行方差分析。

1.7 土壤線蟲群落指數分析

根據土壤線蟲物種信息劃分營養類群：食細菌線蟲（bacterivores，Ba）、植食性線蟲（plant parasitic nematodes，PP）、食真菌線蟲（fungivores，Fu）、雜食-捕食性線蟲（omnivores-predatores，Om），將分離得到的每個屬線蟲賦予c-p 值（colonize-persister），并計算各線蟲營養類群相對豐度和群落指數（Shannon et al.，1950；Ferris et al.，2001）。

富集指數EI=100×〔e/（e+b）〕

式中，b包括Ba2 和Fu2 類群，e包括Ba1 和Fu2 類群。

結構指數SI=100×〔s/（s+b）〕

式中，s包括 Ba3-Ba5（c-p 值為3～5 的食細菌線蟲比例）、Fu3-Fu5（c-p 值為3～5 的食真菌線蟲比例）、Om3-Om5（c-p 值為3～5 的雜食-捕食線蟲比例）類群。

線蟲通路指數 NCR=NBa/（NBa+NFu）

式中NBa指食細菌性線蟲的數量，NFu指食真菌性線蟲的數量。

為了分析轉基因黃瓜和非轉基因黃瓜根際土壤線蟲群落的差異，采用SPSS 軟件對EI、SI 和NCR 進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 土壤線蟲類群分析

非轉基因黃瓜根際土壤線蟲文庫分別獲得73、75 和78 個有效克隆子。轉基因黃瓜根際土壤線蟲文庫分別獲得74、75 和76 個有效克隆子。以97%閾值劃分OTU，非轉基因黃瓜根際土壤線蟲文庫分別獲得22、23、23 個OTU；轉基因黃瓜土壤線蟲文庫獲得23、25、22 個OTU。

在線蟲屬分類水平上，轉基因黃瓜根際土壤獲得13 個線蟲屬，分別為：小桿線蟲屬（Rhabditis）、頭葉線蟲屬（Cephalobus）、擬麗突線蟲屬（Acrobelodies）、根結線蟲屬（Meloidogyne）、原桿線蟲屬（Protorhabditis）、孢囊線蟲屬（Heteroder）、矮化線蟲屬（Tylenchorhycbus）、短體線蟲屬（Pratylenchus）、莖線蟲屬（Ditylenehus）、滑刃線蟲屬（Aphelenchoides）、胼眂擬毛刺線蟲屬（Paratrichodorus）、棱咽線蟲屬（Prismatolaimus）、遍宮線蟲屬（Ecumenicus）。非轉基因黃瓜根際土壤獲得除原桿線蟲屬、棱咽線蟲屬、胼眂擬毛刺線蟲屬以外的10 個線蟲屬。轉基因黃瓜和非轉基因黃瓜根際土壤線蟲優勢屬都為：小桿線蟲屬、頭葉線蟲屬、擬麗突線蟲屬。小桿線蟲屬線蟲在轉基因黃瓜和非轉基因黃瓜根際土壤中所占比例較高且相近，分別為44.0%和36.0%。頭葉線蟲屬在轉基因黃瓜和非轉基因黃瓜根際土壤中占第2 位，分別為22.9%和23.3%。擬麗突線蟲屬在轉基因黃瓜和非轉基因黃瓜根際土壤中所占比例分別為8.6%和9.6%（圖1-A 和1-B）。

圖1 轉基因黃瓜和非轉基因黃瓜根際土壤線蟲各屬比例

2.2 土壤線蟲營養類群分析

轉基因黃瓜和非轉基因黃瓜根際土壤中食細菌線蟲為優勢營養類群，所占比例分別為77.1%和73.2%，無顯著差別（圖2）。植食性線蟲居第二位，所占比例分別為20.0%和25.4%差異顯著（P=0.003），其中非轉基因黃瓜根際土壤中植食性線蟲比例高于轉基因黃瓜，主要源于非轉基因黃瓜根際土壤中根結線蟲數量較多，這也證實轉基因黃瓜對根結線蟲具有一定的抑制作用。食真菌線蟲和捕食性線蟲在轉基因黃瓜和非轉基因黃瓜根際土壤中均為稀有類群，所占比例較小。

圖2 轉基因黃瓜和非轉基因黃瓜根際土壤線蟲營養類群

2.3 土壤線蟲多樣性指數分析

從多樣性指數來看（表1），轉基因黃瓜和非轉基因黃瓜根際土壤線蟲的Shannon 指數、Simpson 指數以及土壤線蟲的物種數目（S）均與非轉基因黃瓜無顯著差異。總體來看，轉基因黃瓜土壤線蟲的多樣指數與非轉基因黃瓜無顯著差異。

表1 轉基因黃瓜和非轉基因黃瓜根際土壤線蟲多樣性指數

2.4 土壤線蟲群落指數分析

從土壤線蟲群落指數來看（表2），轉基因黃瓜根際土壤線蟲的富集指數（EI）、結構指數（SI）以及土壤線蟲的線蟲通路指數（NCR）與轉非基因黃瓜均無顯著差異。

表2 轉基因黃瓜和非轉基因黃瓜根際土壤線蟲生態指數

3 結論與討論

本試驗發現，轉mapk基因黃瓜根際土壤線蟲優勢類群與非轉基因黃瓜基本一致，均為小桿線蟲屬、頭葉線蟲屬和擬麗突線蟲屬。研究表明，小桿線蟲屬線蟲對土壤環境適應性強，生活史短，世代交替快，繁殖迅速，因此種群數量多，在各類型土壤中均為優勢類群，這與本試驗結果一致（曾四滿，2016；趙婉婷 等，2019）?？自频龋?018）研究發現玉米田土壤中頭葉線蟲屬線蟲為優勢類群，也表明該屬線蟲具有較強的適應能力，與本試驗結果較為一致。擬麗突線蟲屬線蟲具有很寬的生態幅（12～35 ℃），對溫度要求較低，環境適應能力較強（Anderson &Coleman，1982；Bakonyi &Nagy，2000；郭佳惠 等，2018）。本試驗中擬麗突線蟲屬線蟲的比例相對較高，也表明該線蟲適應大棚土壤溫度環境。轉基因黃瓜和非轉基因黃瓜根際土壤線蟲的線蟲通路指數均較高，表明溫室土壤有機質分解過程以細菌通道為主，細菌豐度高，為食細菌線蟲提供豐富食物來源，這也是食細菌線蟲成為優勢類群的主要原因。

從土壤線蟲多樣性指數和生態指數來看，轉基因黃瓜和非轉基因黃瓜根際土壤線蟲群落的Shannon、Simpson、EI、SI 和NCR 指數無顯著差異，表明轉mapk基因黃瓜并未對根際土壤線蟲產生顯著的影響，其原因可能有兩方面：一方面，土壤線蟲包括食細菌線蟲、食真菌線蟲和雜食-捕食性線蟲，主要取食土壤細菌、真菌或其他線蟲，不取食植物。因此，轉基因黃瓜表達的mapk雙鏈RNA 不會對這幾類線蟲產生直接作用（閆小梅，2015）。另一方面，轉基因黃瓜表達的mapk雙鏈RNA 隨根系分泌物進入土壤，可能被土壤中的RNA 酶所降解，失去生物活性（王艷艷 等，2015），不能發揮對土壤線蟲的抑制作用。此外，本試驗發現土壤線蟲中也有一定數量的根結線蟲，并且根結線蟲在轉基因黃瓜根際土壤線蟲中所占比例較低，表明轉基因黃瓜對根結線蟲有一定的抑制作用。本試驗中選用的轉基因黃瓜植株能夠表達的mapk雙鏈 RNA，對侵入黃瓜根內的根結線蟲進行RNA 干擾，從而殺死根結線蟲（陳國華，2008）。

總體來看，轉mapk雙鏈RNA 表達載體黃瓜并未對土壤線蟲多樣性有顯著影響，但后續需繼續觀察長期的累積效應，其對根際土壤真核生物群落的影響還需深入研討。