103份馬鈴薯種質資源的耐寒性評價

丁紅映 熊興耀， 王萬興 胡新喜 田宇豪 秦玉芝*

（1 湖南農業大學園藝園林學院，湖南省馬鈴薯工程技術研究中心，湖南長沙 410128；2 中國農業科學院蔬菜花卉研究所，農業農村部薯類作物生物學與遺傳育種重點實驗室，北京 100081）

植物對低溫的適應性受多基因調控，耐寒性評價從低溫脅迫下植物的表型特征、細胞生理生化變化、分子響應等不同層面進行（陳林波，2010；許英 等，2015），常見的評價方法有直接鑒定法和間接鑒定法兩類。直接鑒定法包括田間自然霜凍法、生長恢復法、人工氣候室法等（李文明 等，2017）。間接鑒定法主要有測定細胞膜電導率、氧化還原酶系統、可溶性糖含量、脯氨酸含量、葉綠素熒光參數以及NBT/DAB組織原位顯色等。其中，田間自然霜凍法、測定細胞膜電導率和生理生化指標較為常見。魏亮（2012）采用電導率法和田間自然霜凍法評價了116 份馬鈴薯材料的耐寒性。楊慧菊和郭華春（2016）通過測定相對電導率、過氧化物酶活性、超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量和可溶性蛋白含量評價了10 個馬鈴薯品種的耐寒性。

植物耐寒性是數量遺傳性狀，單一指標難以準確地反映耐寒性的強弱，采用不同分析方法綜合衡量，可以增強評價的準確性（楊慧菊和郭華春，2016）。應用不同分析方法綜合評價植物的逆境耐受性已有諸多報道，如采用隸屬函數分析和聚類分析相結合的方法評價作物耐鹽性（穆志新 等，2017；李青 等，2018；牛遠 等，2018；耿雷躍 等，2019）、耐高溫性（曾小玲 等，2010；朱朝輝 等，2011；韓瑞宏 等，2015；靳路真 等，2016）、抗旱性（謝小玉 等，2013；張慶華 等，2018；孫豐磊 等，2019）、耐低溫性（黃超 等，2018）等。

馬鈴薯喜冷涼但不耐霜凍，中國南方冬閑田是馬鈴薯“主糧化”目標下開發的重點區域，該區域秋冬作馬鈴薯在生長期間容易遭受持續低溫以及霜凍危害，造成減產或絕收（熊興耀 等，2008）。利用科學的方法對馬鈴薯耐寒性進行評價，提高馬鈴薯耐寒種質篩選的準確性，對于馬鈴薯耐寒育種研究以及區域生態強適應型品種培育具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試103 份馬鈴薯材料從中國馬鈴薯資源庫、黑龍江省農業科學院克山分院、中國農業科學院蔬菜花卉研究所、華中農業大學園藝林學學院、國際馬鈴薯中心（CIP）亞太中心（中國）、美國威斯康星州馬鈴薯種質庫（USDA）等單位引進，材料編號、名稱、來源及選育區域詳見表1。

表1 供試馬鈴薯材料的編號、名稱、來源及選育區域

續表

1.2 試驗方法

1.2.1 電導率法 2018 年9 月初在湖南農業大學馬鈴薯工程中心組培室進行組培苗擴繁，每份材料5 瓶，每瓶5～6 株，光照強度為3 200 lx，光周期為14 h/10 h（光照/黑暗，下同），溫度為20～22 ℃，生長25 d 后移栽于人工氣候室，光照強度為5 500 lx，光周期為14 h/10 h，溫度為20～22 ℃，生長50 d 后取功能葉片（以倒數第3、4 節位的葉片最佳）1～2 片測定電導率。

電導率的測定參照李飛等（2008）的方法略作改動：將功能葉片用蒸餾水反復沖洗并吸干葉片表面水分，放入50 mL 帶蓋的離心管中，封口后置于程序降溫儀內，初始溫度為0 ℃，保持30 min，在離心管底部加入少許冰塊，繼續保持30 min 后，溫度由0 ℃降至-1 ℃，處理1 h 后取樣，溫度由-1℃降至-2 ℃，處理1 h 后取樣，以此類推，直至溫度降至-7 ℃。每次取樣后，將離心管放在冰上解凍；將解凍葉片剪成1.5 mm 左右的條形，盡量避開主脈，稱取0.1 g，加入10 mL 去離子水，充分浸泡，設3 次重復。12 h 后搖勻，測定電導率R1，在100℃水浴鍋中煮沸20 min，冷卻至室溫，搖勻，測定電導率R2。電解質滲出率=R1/R2×100%，求出3 次電解質滲透率的平均值，用Logistic 方程擬合。電解質滲透率與低溫處理溫度之間遵循Logistic 方程的變化規律，用曲線拐點表示各馬鈴薯品種的半致死溫度（丁旭 等，2017）。

1.2.2 田間自然霜凍法 2018 年10 月10 日在湖南農業大學馬鈴薯工程中心組培室進行組培苗擴繁，每份材料5 瓶，每瓶5～6 株，光照強度為3 200 lx，光周期為14 h/10 h，溫度為20～22 ℃，生長30 d 后于11 月10 日移栽至室外，每份材料種植3盆，每盆4～5 株，3 次重復。2018 年12 月中旬至2019 年1 月中旬，湖南長沙地區霜凍和冰雪等寒冷天氣符合馬鈴薯生長期間自然霜凍評價條件。

田間自然霜凍法根據葉片的顏色、水漬斑以及莖稈的透明度來評價植物的抗凍性，植物受凍害程度越低，說明耐寒性越強（李文明 等，2017）。Vega 和Bamberg（1995）、Chen 等（1999）將植物的凍害情況劃分為7 個等級：0 級，沒有損傷；1 級，頂葉受到輕微傷害；2 級，頂葉少部分凍死；3 級，大多數頂葉凍死；4 級，所有頂葉及葉柄凍死；5 級，所有葉片凍死；6 級，整株凍死。

1.3 主要儀器

試驗用儀器包括程序降溫儀、DDSJ-308A 型電導率儀、天平、50 mL 離心管、水浴鍋等。

1.4 數據統計分析

數據處理采用Microsoft Excel 2010 軟件，聚類分析、半致死溫度計算采用SPSS 22.0 軟件。

1.4.1 隸屬函數分析 耐寒系數和隸屬函數計算參考謝季堅和劉承平（2005）、楊金紅（2007）的方法。

耐寒系數=處理測量值/對照測量值×100% ①

隸屬函數值u（Xij）=（Xij-Xmin）/（Xmax-Xmin） ②

反隸屬函數值u（Xij）=1-（Xij-Xmin）/（Xmax-Xmin） ③

其中，u（Xij）為第i個品種第j個指標的隸屬函數值，Xij為耐寒系數，Xmin為所有供試材料中第j個指標耐寒系數的最小值，Xmax為所有供試材料中第j個指標耐寒系數的最大值。如果耐寒指標與耐寒程度呈正相關，用公式②計算，反之用公式③計算。

1.4.2 耐寒性鑒定標準 采用隸屬函數法對試驗材料進行耐寒性排序，隸屬函數度參考張文娥等（2007）的方法。0.70≤u（Xij）≤1.00 為高耐，劃為Ⅰ級；0.60≤u（Xij）≤0.69 為耐寒，劃為Ⅱ級；0.40≤u（Xij）≤0.59 為中耐，劃為Ⅲ級；0.30≤u（Xij）≤0.39 為低耐，劃為Ⅳ級；0≤u（Xij）≤0.29 為不耐，劃為Ⅴ級。

2 結果與分析

2.1 103 份馬鈴薯種質資源耐寒性隸屬函數法評價結果

2018 年12 月28 日至2019 年1 月3 日，湖南長沙地區遭遇連續6 d 低溫天氣，最低溫度在0 ℃以下，形成了很好的自然霜凍評價條件。12 月31日至翌年1 月1 日降雪，待雪融化后，1 月3 日對103 份馬鈴薯種質資源耐寒性進行田間自然霜凍法評價（圖1）。隨著氣溫的恢復，1 月20 日再次統計了馬鈴薯種質資源的耐寒等級，與1 月3 日的結果基本一致。

圖1 田間自然霜凍條件下部分馬鈴薯種質資源的耐寒性評價

根據公式③和1.5.2 的耐寒性鑒定標準，采用隸屬函數法對半致死溫度和霜凍表型分級的兩個指標進行分析。如表2 所示，半致死溫度隸屬函數值劃分為Ⅰ級〔0.7≤u（Xij）≤1.0〕的有16 份材料，屬于高耐，占供試材料的15.5%；Ⅱ級〔0.60≤u（Xij）≤0.69〕有6 份材料，屬于耐寒，占供試材料的5.8%；Ⅲ級〔0.40≤u（Xij）≤0.59〕有39份材料，屬于中耐，占供試材料的37.9%；Ⅳ級〔0.30≤u（Xij）≤0.49〕有21 份材料，屬于低耐，占供試材料的20.4%；Ⅴ級〔0≤u（Xij）≤0.29〕有21 份材料，屬于不耐，占供試材料的20.4%。

霜凍表型分級隸屬函數值劃分為Ⅰ級的有17份材料，屬于高耐，占供試材料的16.5%；Ⅱ級有8 份材料，屬于耐寒，占供試材料的7.8%；Ⅲ級有20 份材料，屬于中耐，占供試材料的19.4%；Ⅳ級有10 份材料，屬于低耐，占供試材料的9.7%；Ⅴ級有48 份材料，屬于不耐，占供試材料的46.6%。

表2 103 份馬鈴薯種質資源耐寒性隸屬函數法評價結果

續表

通過上述分析，采用電導率法和田間自然霜凍法評價的隸屬函數值為Ⅰ級（高耐）的分別占15.5%和16.5%，兩者僅相差1 個百分點，Ⅱ級（耐寒）分別占5.8%和7.8%，兩者相差2.0 個百分點，但是Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級的占比差異較大。電導率法的Ⅲ級（中耐）、Ⅳ級（低耐）、Ⅴ級（不耐）占比分別為37.9%、20.4%、20.4%；而田間自然霜凍法分別為19.4%、9.7%、46.6%，Ⅴ級（不耐）占比擴大，其他等級的比例縮小。產生這種現象的原因可能是在田間自然霜凍法評價的過程中，溫度和時間無法人為控制，持續的低溫脅迫將大多數中間抗性材料歸為Ⅴ級，即耐寒性最差的一類。

2.2 103 份馬鈴薯種質資源耐寒性聚類分析結果

將103 份馬鈴薯材料的半致死溫度進行聚類分析（表3、圖2），得到58 份不耐寒和低耐寒材料，占供試材料的56.3%；29 份中耐寒材料，占供試材料的28.2%；16 份耐寒和高耐寒材料，占供試材料的15.5%。霜凍表型分級聚類分析（表3、圖3）得到61 份不耐寒和低耐寒材料，占供試材料的59.2%；19 份中耐寒材料，占供試材料的18.4%；23 份耐寒和高耐寒材料，占供試材料的22.3%。電導率擬合方程分析材料的半致死溫度（LT50）與霜凍表型分級結果呈極顯著正相關，相關系數為0.747，表明電導率法鑒定的結果真實可信，與馬鈴薯材料在田間低溫霜凍環境下存活情況高度一致。兩種方法的聚類分析結果相差不大，但是從品種來看，華恩1 號（半致死溫度聚類為1 類，霜凍表型分級聚類為3 類）、中薯17 號（半致死溫度聚類為1 類，霜凍表型分級聚類為3 類）的跨度較大，其他材料的聚類跨度較小。

表3 103 份馬鈴薯種質資源耐寒性聚類分析結果

圖2 半致死溫度聚類分析

圖3 霜凍表型分級聚類分析

2.3 不同來源的馬鈴薯種質資源耐寒性比較

采用隸屬函數法和聚類分析法比較103 份不同來源的馬鈴薯種質資源的耐寒性，如表4 所示，隸屬函數法的鑒定結果是，采用半致死溫度和霜凍表型分級評價的中等以上耐寒性資源分別占供試材料的21.36%和24.27%，國外引入材料分別占28.13%和28.13%，國內材料分別占18.31%和22.54%；中等耐寒性資源分別占供試材料的37.86%和19.42%，國外引入材料分別占40.63%和31.25%，國內材料分別占36.43%和14.08%；敏感資源分別占供試材料的40.78%和56.31%，國外引入材料分別占31.25%和40.62%，國內材料分別占45.07%和63.38%。

聚類分析法的鑒定結果是，采用半致死溫度和霜凍表型分級評價的1 類資源分別占供試材料的56.31%和59.22%，國外引入材料分別占43.75%和43.75%，國內材料分別占61.97%和66.22%。2類資源分別占供試材料的28.16%和18.45%，國外引入材料分別占34.37%和28.13%，國內材料分別占25.35%和14.08%。3 類資源分別占供試材料的15.53%和22.33%，國外引入材料分別占21.88%和28.13%，國內材料分別占12.68%和19.72%。

表4 103 份不同來源的馬鈴薯種質資源耐寒性比較

隸屬函數法和聚類分析法的結果均表明國外引入種質資源的耐寒性強于國內，國內種質資源中北方一作區的耐寒性強于西南混合區。湖南馬鈴薯工程技術研究中心以耐低溫性強為目標引入國外材料是國外材料耐寒性整體偏高的主要原因；另外，北方一作區為我國馬鈴薯主產區，選育的馬鈴薯品種類型豐富，適應性廣，因此從優勢區域引進馬鈴薯資源，進行冬作生態環境強適應型品種篩選始終是南方馬鈴薯產業發展的有效措施。

3 討論與結論

馬鈴薯作為世界范圍內主要的糧食作物之一，在我國農業生產中具有重要的地位。目前在馬鈴薯普通栽培種中沒有發現耐寒性較好的資源，但野生種在長期的進化和適應過程中產生了諸多的變異類型，形成了抗逆性強特異品種性狀豐富等特點，所以對包括野生種在內的耐寒種質資源進行挖掘，是拓展馬鈴薯抗性遺傳背景的有效手段（康黎，2017）。國際上馬鈴薯耐寒性研究起步較早，電導率分析法和田間自然霜凍法也是國內外學者普遍使用的方法。電導率法技術完善，不受季節的限制，應用較廣泛，在獼猴桃（楊超英 等，2014）、小麥（趙瑞玲 等，2019）、櫻桃（任惠 等，2016）等抗寒性研究中取得較好效果，但是該方法操作繁瑣，周期長，對測試葉片的生長一致性要求高，重復性不好，大批量材料的篩選受到限制（魏亮，2012）。田間自然霜凍法的分級細致合理，結果可靠，適合大批量的供試材料篩選，但該方法周期性長，受季節的限制，冰（霜）凍程度和時間不可控制。另外，采用單一指標很難用于機理十分復雜的耐寒性分析，本試驗在測定2 個指標的基礎上，引入科學的分析方法，為綜合評價馬鈴薯耐寒性資源提供了新的思路。

本試驗采用電導率法和田間自然霜凍法的兩個指標，綜合隸屬函數分析法和聚類分析法評價了103 份馬鈴薯資源的耐寒性。結果發現，馬鈴薯普通栽培種具有一定耐寒性的大多數材料半致死溫度在-2.11～-0.72 ℃之間（半致死溫度聚類在第1類，材料58 份，占比56.3%），田間自然霜凍評價等級在3.8～6.0 級之間（霜凍表型分級聚類在第1類，材料61 份，占比59.2%），本試驗對馬鈴薯普通栽培種的耐寒性分級與前人的研究結果一致（魏亮 等，2017）。隸屬函數法對田間自然霜凍等級評價的中等以上耐寒材料、中等耐寒材料、敏感材料所占比例分別是24.27%、19.42%、56.31%，而聚類分析法對田間自然霜凍等級評價的3 類、2 類、1 類所占比例分別是22.33%、18.45%、59.22%，兩種方法差值的絕對值分別是0.97%、0.97%、2.91%，說明半致死溫度和霜凍表型分級鑒定結合隸屬函數法和聚類分析法能夠有效評價馬鈴薯種質資源的耐寒性。

綜合電導率法和田間自然霜凍法評價結果，本試驗得到Anti-10、隴薯5 號、Sten-1、中薯10 號、389746.2、龍薯4 號、Lxs-4、l0004-12、中薯12號、春薯1 號、冀張14 號、中薯170 號、Vio-9、紅美、中薯4 號、10-14、01-44、新大坪、中薯8 號、中薯3 號、GS397 等21 份不耐寒材料，半致死溫度在-1.58～-0.72 ℃之間，評價等級為4～6 級。同時得到Funday、AV9、BS214、396034.268、狗頭山藥、臨薯3 號、烏蒙684、康薯53、CBADG-16X、河壩洋芋、ФИΤΟФΤΟΡΟy СΤΟЙЧИВЫЙ、中薯2 號、F170 F171、acancle-4、CBADG-13X、GS393 等16 份耐寒性較好的材料，半致死溫度在-3.80～-2.90 ℃之間，霜凍表型分級為0.20～2.00級，其中，GS393 耐寒性最強，半致死溫度為-3.8℃，霜凍表型分級為0.20 級。