分子印跡固相萃取-流動注射化學發光法測定蔬菜中甲基對硫磷

(中化地質礦山總局浙江地質勘查院，杭州 310000)

農藥甲基對硫磷(Methyl Parathion, MP，化學名O,O-二甲基-O-對硝基苯基)硫代磷酸酯，結構式如圖1所示。是一種廣泛使用的高效光譜有機磷殺蟲劑，在蔬菜農作物種植等農業生產的各個環節使用相當廣泛。甲基對硫磷具有強烈的觸殺和胃毒作用，是一種具有神經毒性的物質，能夠通過抑制生物體內的乙酰膽堿酯酶的活性，因此各國政府對其在食品或果蔬中的殘留都有嚴格的限量規定。目前，測定有機磷農藥的方法主要有氣相色譜法[1]，液相色譜法[2]，氣質聯用[3]，液質聯用[4]等色譜分析方法，但是色譜分析方法需要對樣品進行復雜的預處理，需要專門的技術人員，且儀器設備昂貴。近年來，生物免疫技術的不斷發展，免疫法[5]，生物傳感器法[6]其檢測靈敏度高，特異性強對有機磷農藥的檢測也不斷發展，受到越來越多的科研工作者的青睞。但是生物免疫的分析方法以及生物傳感器等需要大量的生物抗體與酶物質，而抗體與酶反應的條件要求苛刻，在復雜的樣品環境中極易失活，其應用受到限制。

化學發光法靈敏度高，且線性范圍寬，在線連續檢測中顯示出獨特優勢，已有大量的文獻報道其應用于有機磷農藥的檢測[7-9]。雖然化學發光靈敏度高，但是化學發光選擇性差，也進一步限制了其廣泛的應用。分子印跡技術(molecular imprinted technical, MIT)是最針對特定目標分子制備出具有高的選擇性，高親和性能的分子印跡聚合物技術[10]。分子印跡聚合物(molecular imprinted polymer, MIP)中具有大量的與目標分子相匹配的空穴和高度互補的功能基團，可以實現對目標分子識別與捕獲，因此，分子印跡聚物有良好的選擇性[11]。

本研究以甲基對硫磷分子為模板分子，丙烯酰胺為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑合成制備了甲基對硫磷分子印跡聚合物。以甲基對硫磷分子印跡聚合物為載體制備分子印跡固相萃取小柱實現對甲基對硫磷分析的選擇性富集，結合化學發光技術，建立了高靈敏度，高選擇性的甲基對硫磷-魯米諾-過氧化氫化學發光的分析方法，并進行實際樣品的檢測。

圖1 甲基對硫磷分子結構式

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

IFFM-D型流動注射化學發光儀(西安瑞邁電子科技有限公司)，蠕動泵以1.5 mL min-1的速度輸送所有溶液；RET控制型C加熱磁力攪拌器(德國IKA集團)；臺式恒溫振蕩器(上海一恒儀器)；H1650-W型高速離心機(湖南湘儀離心機)；電熱鼓風干燥箱，真空干燥箱等。

魯米諾(Sigma-Aldrich，美國)；甲基對硫磷(百靈威科技有限公司)；丙烯酰胺(國藥集團化學試劑有限公司)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，國藥集團化學試劑有限公司)；偶氮二異丁腈(AIBN，天津市博迪化工有限公司)；乙腈，乙酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；實驗用水均為二次蒸餾水。

1.2 甲基對硫磷分子印跡聚合物的制備

按照參考文獻[11]，稱取0.5 mmoL丙烯酰胺，0.1 mmoL甲基對硫磷溶于25 mL氯仿中，超聲分散均勻，在4 ℃冰浴中預聚合2 h后，然后再加入8 mmoL交聯劑EGDMA，15 mg引發劑AIBN，通氮氣脫氧20 min，保持氮氣氛置于60 ℃的油浴中均勻攪拌加熱聚合24 h，得到乳白色懸濁液。離心分離洗滌后，使用CH3OH/CH3CH2COOH(v/v, 8∶2)的洗脫液洗脫模板分子，直到洗脫液通過紫外分光光度計檢測不出甲基對硫磷的紫外吸收峰為止，最后通過二次蒸餾水洗滌直至中性，烘干，即得到甲基對硫磷分子印跡聚合物(MIP)。同樣，非印跡聚合物(NIP)的制備，除不加甲基對硫磷外，其余步驟均與MIP的制備過程相同。

1.3 甲基對硫磷分子印跡固相萃取柱的制備

稱取10 mg 已經除盡模板分子的印跡聚合物填充到?4 mm × 20 mm的石英玻璃管內，兩端用玻璃棉封口，以防流失，制備成為甲基對硫磷分子印跡固相萃取柱(MIP-cell)。將此MIP-cell連接在流路中，置于光電倍增管的光窗上，以保證產生的化學發光全部檢測。

1.4 甲基對硫磷MIP靜態結合實驗

準確稱取甲基對硫磷MIP或者NIP 15.0 mg放入20 mL離心管中，加入10 mL甲基對硫磷溶液，在室溫條件下攪拌12 h，然后離心分離，取上層清夜用紫外分光光度計在225 nm處測定平衡吸附液中甲基對硫磷的濃度。平行測定3次，根據吸附前后溶液中甲基對硫磷濃度的變化，計算甲基對硫磷MIP的吸附量Q。

1.5 化學發光分析

在線富集化學發光分析步驟可分為以下幾步：(1)MIP-cell對甲基對硫磷的富集；(2)通過蒸餾水洗滌非選擇性的雜質分子；(3)通入魯米諾與過氧化氫溶液通過已經富集的MIP-cell進行化學發光反應，檢測化學發光信號；(4)MIP-cell的再生，以備再次檢測。

2 結果與討論

2.1 甲基對硫磷MIP的結合特性

按照實驗步驟，利用靜態結合實驗考察甲基對硫磷MIP的吸附特性。15 mg甲基對硫磷MIP置于20 mL離心管中，再分別加入濃度為1.0 × 10-5mol L-1～ 6.0 × 10-5mol L-1的甲基對硫磷溶液10 mL，測定結果如圖2所示。從圖2中可以看出，隨著甲基對硫磷弄得的逐漸增加，甲基對硫磷MIP (圖2, a)和NIP (圖2, b)對甲基對硫磷的吸附量也是逐漸增加，但是在考察濃度范圍之內甲基對硫磷MIP的吸附量明顯大于NIP的吸附量，且吸附速率也是同樣趨勢。這是因為甲基對硫磷MIP中有大量的與甲基對硫磷分子相匹配的空間空穴，還存在能夠與之作用的功能單體，這樣在吸附的過程中不僅能夠快速吸附，而且還能夠進行分子識別；而NIP則不存在甲基對硫磷的空間空穴，對甲基對硫磷分子的吸附也只是靠物理吸附作用，吸附能力相對較弱。

圖2 甲基對硫磷MIP與NIP結合模板分析的吸附曲線(a).MIP；( b).NIP

2.2 MIP-cell吸附時間與洗滌時間的優化

利用MIP-cell對甲基對硫磷的富集，富集時間是一個很重要的參數，它決定MIP-cell對甲基對硫磷的吸附量，這對于檢測靈敏度以及檢測范圍有很大影響。本實驗按照實驗步驟制備好的MIP-cell考察了吸附時間在30～300 s的范圍內對化學發光強度的影響。實驗結果表明，對于1.0 × 10-7mol L-1的甲基對硫磷溶液在30 ～ 120 s之間隨著時間的增加，其化學發光強度逐漸增加，而超過120 s以后，其化學發光強度趨于穩定，這表明MIP-cell對甲基對硫磷的吸附已經達到平衡。因此，本實驗選擇吸附時間為120 s。

在MIP-cell吸附了甲基對硫磷分子后，不能立即進行化學發光的測定，因為在MIP-cell的死體積中還會殘余有大量的甲基對硫磷以及甲基對硫磷MIP表面非印跡位點的地方也會有物理吸附，這樣對化學發光的測定有非常大的影響。因此，吸附后的洗滌時間也是非常重要。本實驗討論了洗滌時間在30 ～ 100 s的范圍內對化學發光所產生的影響。實驗結果如圖3所示，洗滌時間的增加，首先會將MIP-cell死體積中大量殘余的甲基對硫磷溶液除去，化學發光強度迅速降低；當洗滌時間進一步增加時，在甲基對硫磷MIP表面物理吸附的分子也會被洗脫，最后達到穩定狀態，因此，本實驗選擇的洗滌時間有90 s。

圖3 MIP-cell不同洗滌時間的化學發光強度變化

2.3 化學發光條件的優化

2.2.1魯米諾濃度的選擇

本實驗考察了魯米諾濃度在1 × 10-5～ 1 × 10-3mol L-1范圍內對化學發光強度的影響。結果表明，增加魯米諾的濃度，化學發光強度也會增加，但是空白背景信號也會增加，為了獲得最優的信噪比，本實驗選擇魯米諾的濃度為5 × 10-4mol L-1。

2.3.2過氧化氫濃度的選擇

過氧化氫濃度的大小直接影響化學發光信號的強弱，考察了過氧化氫溶液濃度在0.00 ～ 0.20%范圍內對化學發光強度的影響。實驗結果表明，過氧化氫濃度為0.03%時，化學發射光信號最強，故選擇過氧化氫溶液濃度為0.03%。

2.4 標準曲線，精密度和檢測限

在優化實驗條件下，化學發光強度與甲基對硫磷在8.0 × 10-8～ 6.0 × 10-5mol L-1的濃度范圍內有良好的線性關系，其線性回歸方程為I= 0.6435c+ 2.1382，相關系數0.9969，對1.0 × 10-7mol L-1的甲基對硫磷溶液平行測定11次，其RSD為3.32%，方法檢測限為3.4 × 10-8mol L-1。

2.5 選擇性實驗

在優化的實驗條件下，對1.0 × 10-7mol L-1的甲基對硫磷溶液，分析采用甲基對硫磷MIP和NIP進行干擾實驗討論。實驗考察了溶液中幾種常見的離子，控制干擾水平為5%時，500倍的K+，Zn2+，CO3-，Na+，Mn2+對測定無干擾。實驗同樣考察了與甲基對硫磷分子結構相似的其他幾種有機磷農藥，氯硫磷、亞胺磷、馬拉硫磷、樂果的干擾情況，實驗結果如圖4所示。從圖4中可以看出，I0是表示是甲基對硫磷MIP或NIP吸附甲基對硫磷的化學發光強度，Is表示的是溶液中混入有10倍的干擾物質的化學發光強度，甲基對硫磷MIP在吸附干擾物質前后Is與I0之比(Is/I0)均在0.95到1.05之間，而NIP則表現出差的選擇性。

圖4 干擾實驗

2.6 樣品分析及加標回收率

在蔬菜空白樣品中加入不同濃度的甲基對硫磷標準溶液進行回收率實驗，測定結果如表1所示。從實驗結果可知，加標回收測得的回收率在96.5 ～ 104.7%之間，因此，用本法測定樣品中甲基對硫磷可以得到滿意結果。

表1 蔬菜中樣品回收率

3 結論

分別以甲基對硫磷作為模板分子，丙烯酰胺作為功能單體，以EGDMA為交聯劑，AIBN為引發劑合成分子印跡聚合物微球，制備成MIP固相萃取小柱，與化學發光相結合，能夠方便有效地測出甲基對硫磷的含量，同時具有很好的選擇性，排除了其余農藥殘留對其測定造成的干擾。在8.0 × 10-8～6.0 × 10-5mol L-1的濃度范圍內對甲基對硫磷具有良好的線性關系，方法操作簡單，便捷，可用于蔬菜中痕量甲基對硫磷的富集、測定。