重組大腸桿菌表達凝乳酶工業化研究

王延山 曹沛莉

【摘?要】針對傳統大腸桿菌表達凝乳酶發酵工藝的不足，在 10 m 3 新型高溶氧發酵罐上，對重組大腸桿菌（ Recombinant?E.?Coli）連續流加補料發酵生產凝乳酶進行了工業化研究，優化了培養基配方和工藝條件。 結果表明：優化后的培養基以及工藝條件比優化前菌體濃度與酶活均具有較大的提升，對凝乳酶工業化發展提供了重要的技術支持。

【關鍵詞】凝乳酶;高密度發酵;培養基;流加培養;優化

【中圖分類號】R715???【文獻標識碼】A????【文章編號】1004-7484（2019）12-0112-01

引言

凝乳酶（Chymosin）是奶酪工藝中不可或缺的酶制劑，能使乳中蛋白質凝結成乳酪，在歐美等地制酪市場廣泛應用[1]。凝乳酶早期來源于未斷奶的小牛胃粘膜提取獲得，原料來源受局限，產能較低，成本較高[2]。隨著重組DNA技術和發酵工程的快速發展，凝乳酶基因成功在基因工程菌大腸桿菌中得到表達。但是局限于大腸桿菌一般為胞內酶，且菌體密度難以提高，總體產量不高等因素的制約，整體產能相對較低，在工業化上的應用帶來的經濟效益較差[3-4]。

本研究在常規大腸桿菌發酵所用LB培養基的基礎上進行配方改進，采取高營養以及無機鹽混合配方，并結合在生物反應器中對重組大腸桿菌高密度發酵工藝進行優化，以此達到提升產量的目的。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?菌種?產凝乳酶重組大腸桿菌，由本公司生化實驗室提供

1.1.2?主要儀器?電子分析天平、20L發酵罐及補料系統、顯微鏡、離心機、紫外分光光度計、恒溫搖床等

1.1.3?主要試劑?蛋白胨、酵母粉、氯化銨、消泡劑、甘油、鹽酸硫胺、葡萄糖、微量元素、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氨芐、乳糖、IPTG

1.2?試驗方法

1.2.1?培養基配制?改進前培養基（g/L）

基礎料：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化鈉10g、葡萄糖20g、消泡劑。

補料培養基：蛋白胨30g、酵母粉30g、氯化鈉2g、葡萄糖60g、硫酸鎂3g，磷酸二氫鈉12g、磷酸氫二鈉24g。

改進培養基（g/L）

（1）基礎料：蛋白胨15.65g、酵母粉31.3g、氯化銨2.35g、甘油31.5g、消泡劑、HDM緩沖液43.88ml。

（2）補料培養基：蛋白胨55g、酵母粉110g、氯化銨8.25g、葡萄糖105g、HDM緩沖液150ml、鹽酸硫胺0.055g、微量元素。

（3）HDM緩沖液：磷酸二氫鉀26.6g、磷酸氫二鉀80g、氯化銨26.7g、硫酸鈉13.3g。

1.2.2?菌種培養?從平板上挑取單菌落劃線于LB固體平板，30±1℃培養27h后，在平板上挑選單菌落接入15ml*4（100ml三角瓶）LB液體培養基中，30±1℃，180rpm搖床培養，約15h，轉接至150ml*4（1L三角瓶）擴大培養，培養時間約25小時，測定其OD600值6.0±0.5。

1.2.3?發酵培養?發酵基礎培養基經過高溫滅菌后接入培養好的菌種開始培養，溫度37±1℃，pH值利用氫氧化鈉和鹽酸自動控制維持6.5-7.5，溶氧控制在30%以上。通過補料維持發酵所需碳源和氮源。通過添加IPTG誘導表達凝乳酶，發酵結束收集菌體。

2 結果與分析

2.1?培養基優化后對產量的影響

由表1對比試驗的數據結果可知，菌體總量增加了74.65%，過程數據顯示優勢明顯，目的產物包涵體的單位酶活力有所提高。這是因為新配方在復合碳源氮源方面豐富于原LB培養基，發酵過程啟動速度較快，生長優勢明顯，優化后培養基用甘油替代了優化前培養基的葡萄糖，甘油更有利于微生物的代謝利用。同時，優化后培養基中增加幾種緩沖鹽類，使得反應體系pH值變化相對較緩和，不會因為菌體生長較快，導致的反應體系中pH值變化劇烈，影響菌體生長代謝。微量元素的加入也有利于微生物的生長，微量元素能夠構成有機化合物，調節培養基的滲透壓，恒定微生物發育生長條件，參與酶系反應，維持酶的活性，也可以作為自養微生物的能源，供給生命活動所需的能量。

2.2?不同比生長速率對產量的影響?為了進一步提高菌體密度和蛋白產量，我們采用了指數流加策略。指數流加方式是目前較為有效的流加策略，它不僅可以根據菌體密度的增加和發酵液體積的增大，改變流加速率， 還可以控制恒定的比生長速率，從而避免乙酸的抑制和副產物的形成[5-6]。實驗將比生長速率分別設定為0.1h-1、0.2h-1、0.3h-1，在A600達到100時，開始添加IPTG誘導12h。結果見表2。

由上表可知，在指數流加方式下，0.2h-1的比生長速率較其它比生長速率相比，能夠在較短的時間內獲得較高的菌體濃度，且獲得較高的酶活。這是因為，發酵過程中，過低的補料速度會導致營養缺陷，菌體生長得不到充分的營養和能量需求。而過高的補料速度則會導致乙酸及代謝副產物過多，會導致其它代謝途徑過于旺盛，爭奪營養與能量，溶氧需求急劇增加，進而影響菌體生長及蛋白表達途徑正常代謝。

3?結論

重組大腸桿菌高密度發酵是酶制劑產業化的關鍵問題。目前主要問題包括工程菌的表達穩定性、針對性培養基優化、發酵機理的調控以及如何去避免染菌的威脅。這些問題的解決與豐富工程菌理論、完備檢測與調控手段以及生物反應器的改進息息相關。隨著生物技術工藝與設備的不斷高質量發展，高密度高表達的酶制劑產品將越來越多的能夠實現產業化。

參考文獻

[1]?孟廣震. 凝乳酶研究進展[J]. 微生物學通報， 1987（02）：46-48.

[2]?孫海蛟， 呂敏， 黃艾祥. 我國干酪凝乳酶研究及應用現狀[J]. 中國乳業， 2008， 000（005）：50-52.

[3]?曾祺， 張志國. 微生物凝乳酶研究進展[J]. 中國乳品工業， 2019， 047（003）：30-36.

[4]?龍建銀， 王會信. 外源基因在大腸桿菌中表達的研究進展[J]. 生物化學與生物物理進展， 1997， 024（002）：126-132.

[5]?李民， 陳常慶. 重組大腸桿菌高密度發酵研究進展[J]. 生物工程進展， 2000.

[6]孫艷， 王長城， 張玲， et al. 重組大腸桿菌產膽固醇氧化酶的指數流加策略[J]. 化工進展， 2010（01）：130-133.

作者簡介：王延山（1985.04.06），男，漢，江蘇省鹽城市，本科，化工工程助理工程師，研究方向：酶制劑產業化。