人參皂苷Rg3差異調節前列腺癌細胞PC3和DU145增殖

郭亞萍，陳璐瑤，吳紫璇，張翟軼，鄭紡，彭雁飛

前列腺癌是中老年男性泌尿生殖系統的常見惡性腫瘤。根據2018年全球癌癥數據統計，在全球范圍內，前列腺癌在男性中的發病率僅次于肺癌，排名第二（13.5%），同時也是男性第五大致死惡性腫瘤（6.7%）［1］。隨著人口老齡化和生活方式的西方化，我國前列腺癌的發病率和死亡率也呈上升趨勢［2］。因此尋找和開發治療前列腺癌的有效藥物具有重要的現實意義。

人參皂苷Rg3是從傳統中藥人參中提取的活性單體成分。文獻報道，人參皂苷Rg3 具有顯著的抗癌活性［3］。以人參皂苷Rg3為單一成份的藥物參一膠囊已應用于肺癌和肝癌等的化療輔助治療。體外研究顯示，人參皂苷Rg3 能夠抑制前列腺癌細胞LNCaP 和 PC3 的增殖及 PC-3M 細胞的遷移，并增強前列腺癌細胞對化療藥物多西他賽的敏感性［4］。然而，其對前列腺癌細胞的調節作用及分子機制仍未完全清楚。筆者前期研究發現，25、50和100 μmol/L的人參皂苷Rg3均能夠通過誘導前列腺癌細胞PC3中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的增加來抑制細胞增殖［5］。本研究比較了100 μmol/L人參皂苷Rg3 對PC3 和DU145 細胞增殖的調節作用，并且通過檢測細胞內源性ROS 水平、線粒體膜電位變化和抗氧化蛋白的表達，探討其差異調節PC3 和DU145細胞增殖的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人前列腺癌細胞系PC3 和DU145 購自美國標準生物品收藏中心（American type culture collection，ATCC）；人參皂苷Rg3 購自天津賽智維科技有限公司；RPMI 1640培養液購自美國Thermo Fisher Scientific公司；胎牛血清（FBS）購自南美Lonsera Science SRL 公司；胰蛋白酶購自美國Hyclone公司。CCK-8試劑盒購自蘇州宇恒生物科技有限公司；DCFH-DA 熒光探針試劑盒、JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；超純RNA提取試劑盒購自北京康為生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑PMSF購自北京索萊寶科技有限公司；一抗谷胱甘肽過氧化物酶-1（GPX-1）、超氧化物歧化酶2（SOD2）、β-actin、羊抗兔IgG二抗購自北京博奧森生物技術有限公司；熒光顯微鏡（德國徠卡公司，型號IX2-UCB-2）；流式細胞儀（法國Millipore公司，型號ABC250-22INT）；凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司，型號Gl-1）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人前列腺癌細胞系PC3 和DU145 培養于含10%FBS 的 RPMI 1640 培養液，置于 37 ℃、5%CO2培養箱靜置培養。根據細胞生長狀況，每2～3 d更換培養液，待細胞匯合度達70%～90%時進行胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 CCK-8 法檢測細胞增殖 將體外培養的PC3 和DU145細胞接種在24孔板中，每孔2×104個細胞，待細胞過夜貼壁后，分別使用100 μmol/L 人參皂苷Rg3 和對照試劑DMSO處理細胞0、24、48和72 h。使用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖，按照試劑盒說明書的要求，于檢測前在每孔細胞培養液中加入10%CCK-8檢測試劑，繼續培養1 h，測量每孔培養液在波長450 nm的光密度（OD），實驗重復3次。

1.2.3 DCFH-DA活性氧熒光探針檢測細胞內ROS水平 前期結果已表明25、50和100 μmol/L的人參皂苷Rg3能夠增加PC3 細胞ROS 的水平［5］，本研究 將 DU145 細胞按照 5×104/孔的密度種植在24 孔板中，待過夜培養貼壁后，分別用DMSO和不同濃度人參皂苷Rg3（25、50 和100 μmol/L）處理72 h。使用DCFH-DA 熒光探針試劑盒檢測細胞內ROS 的水平變化，將DCFH-DA 探針用RPMI 1640 培養液稀釋至10 μmol/L，37 ℃處理DU145細胞20 min，隨后用RPMI 1640培養液洗滌細胞3次，在熒光顯微鏡下拍照。實驗重復3次。

1.2.4 JC-1 法檢測細胞線粒體膜電位 將PC3 和DU145 細胞種植在 12 孔板中，分別用 DMSO 和 100 μmol/L 人參皂苷Rg3 處理24 h，按照說明書的要求，使用JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒檢測PC3 和DU145 細胞線粒體膜電位的去極化情況，使用流式細胞儀檢測細胞紅綠熒光的強度變化。實驗重復4次。

1.2.5 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測細胞抗氧化蛋白的表達 體外培養DU145和PC3細胞，使用超純RNA提取試劑盒提取細胞總RNA。使用HiFi-Script cDNA 第一鏈合成試劑盒進行反轉錄。隨后，使用Ultra SYBR Mixture對反轉錄所得cDNA 進行PCR 擴增。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性 15 s，60 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 15 s，共 30 個循環。實驗重復3次，以次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HPRT）基因作為內參，所用引物序列見表1。使用1%濃度的瓊脂糖凝膠分離RT-PCR產物，在凝膠成像儀下觀察拍照。

Tab.1 Primer sequence for RT-PCR表1 RT-PCR所用引物序列

1.2.6 Western blot 檢測GPX-1 和SOD2 蛋白表達情況 使用RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF 提取PC3 和DU145 細胞總蛋白。BCA 法檢測蛋白濃度，取15 μg 總蛋白加入到12%SDS-PAGE 凝膠點樣孔內，常規電泳分離后將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入稀釋后的一抗（GPX-1 1∶300，SOD2 1∶500，β-actin 1∶8 000）后于 4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜6 次后加入稀釋后的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，TBST 洗膜6 次，采用ECL化學發光法曝光。以β-actin作為內參。實驗重復3次。

1.3 統計學方法 使用SPSS 22.0 軟件進行統計學處理，符合正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗或重復測量資料方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人參皂苷Rg3 對前列腺癌細胞增殖的調節作用 結果表明，100 μmol/L 人參皂苷Rg3 處理細胞24、48和72 h后，PC3細胞的增殖被明顯抑制（F分組=78.919、F時間=801.935、F交互=20.068，均P＜0.001），見圖1A；與對照組相比，DU145 的增殖不受人參皂苷Rg3的影響（F分組=0.007、P=0.936，F時間=101.145、P＜0.001，F交互=0.244、P=0.660），見圖1B。

Fig.1 CCK-8 assay for the effects of ginsenoside Rg3 on the proliferation of PC3 and DU145 cells圖1 CCK-8實驗檢測人參皂苷Rg3對PC3和DU145細胞增殖的調節作用

2.2 人參皂苷Rg3 上調DU145 細胞中ROS 的水平結果表明，與對照組相比，25、50 和100 μmol/L 的人參皂苷Rg3 均能上調DU145 細胞中ROS 的水平，見圖2。

Fig.2 Ginsenoside Rg3 up-regulated the ROS levels in DU145 cells(×100)圖2 人參皂苷Rg3上調DU145細胞中ROS的水平（×100）

2.3 人參皂苷Rg3 誘導前列腺癌細胞線粒體膜電位去極化 結果顯示，人參皂苷Rg3 可誘導前列腺癌細胞線粒體膜電位的去極化。其中，PC3 細胞紅綠熒光的比值從對照組的1.03±0.28 下降到人參皂苷Rg3 處理組的0.34±0.04（n=4，t=4.251，P=0.022），見圖3。DU145 細胞紅綠熒光的比值從對照組的6.65±1.74 下降到人參皂苷 Rg3 處理組的 1.18±0.07（n=4，t=5.427，P=0.012），見圖4。

Fig.3 Ginsenoside Rg3 induced mitochondria membrane potential changes in PC3 cells圖3 人參皂苷Rg3誘導PC3細胞線粒體膜電位極化改變

Fig.4 Ginsenoside Rg3 induced mitochondria membrane potential changes in DU145 cells圖4 人參皂苷Rg3誘導DU145細胞線粒體膜電位極化改變

2.4 DU145 和PC3 細胞抗氧化蛋白的表達水平差異 結果顯示，GPX-1（n=3，t=5.115，P=0.034）和SOD2（n=3，t=3.283，P=0.030）在DU145 中的表達顯著高于PC3細胞，其他蛋白（GPX-1、GPX-3、NQO1、SOD1、SEPP1、NRF2）表達水平在兩種細胞中并未檢測出顯著差異，見圖5A、C。進一步通過免疫印跡法證明，DU145 中 GPX-1（n=3，t=4.692，P=0.009）和SOD2（n=3，t=5.916，P=0.004）的蛋白表達也顯著高于PC3細胞，見圖5B、D。

3 討論

3.1 藥物誘導內源性ROS 增加可能是抑制癌細胞的有效策略之一 高水平的ROS可以通過改變細胞內物質代謝和信號通路起到殺傷癌細胞的作用。通過藥物誘導癌細胞內的氧化壓力抑制癌細胞增殖或促進其凋亡是癌癥治療的一種新的策略。Choi等［6］報道了利用殼聚糖-巖藻多糖納米顆粒裝載的促氧化藥物Piperlongumine 通過誘導細胞內ROS 的產生殺死前列腺癌細胞。Zhang 等［7］報道了裝載有丹參抗癌成分的銀納米顆粒能夠通過誘導細胞內ROS促進前列腺癌細胞系LNCaP 的凋亡。Elkady［8］研究顯示，閉鞘姜提取物（C.speciosus）也能夠通過增加PC3細胞內ROS 促進細胞凋亡。筆者前期研究發現，人參皂苷Rg3 能夠有效抑制PC3 細胞增殖，阻滯細胞周期從G1期向S期轉化；同時發現，其抑制PC3細胞的增殖是通過誘導細胞內源性ROS 增加而實現的［5］。

Fig.5 RT-PCR and Western blot assays for the different expressions of antioxidants in DU145 and PC3 cells圖5 RT-PCR和免疫印跡法比較DU145和PC3細胞中抗氧化蛋白的表達

3.2 不同類型癌細胞對人參皂苷Rg3 可產生差異性應答 相同濃度的人參皂苷Rg3在PC3和DU145細胞中表現出不盡相同的調節效應。在DU145細胞中，盡管人參皂苷Rg3 能夠上調細胞內源性ROS 水平，誘導線粒體膜電位去極化，但對于細胞增殖的抑制卻并不顯著。早在2014年，Jayakumar等［9］報道了這2 種細胞對電離輻射的應答差異，發現DU145 細胞對電離輻射有更強的抵抗性，這是由于PC3 細胞中具有較高的ROS 水平，同時谷胱甘肽（GSH）含量以及NF-E2相關因子-2（NRF2）的表達水平較低，因此對氧化損傷的抵抗性更差。Nogueira 等［10］從信號通路的角度對此進行探討，發現蛋白酪氨酸磷酸酶基因（PTEN）缺失的癌細胞與帶有野生型PTEN的癌細胞相比Akt 高度激活，其細胞內ROS 水平較高。在2種細胞系中，DU145表達野生型的PTEN，而PC3則是 PTEN 缺失的［11］。細胞內高 ROS 水平可能使PC3 細胞對ROS 誘導的細胞死亡更加敏感，提示PTEN-Akt 信號通路的差異導致了不同前列腺癌細胞對氧化壓力的耐受能力不同。本研究也比較了2種細胞系抗氧化蛋白的表達差異，發現與PC3 細胞相比，DU145細胞高表達GPX-1和SOD2基因，這有可能導致DU145和PC3細胞對人參皂苷Rg3的差異應答。綜上所述，不同的前列腺癌細胞對人參皂苷Rg3 的敏感度不同，在應用其治療前列腺癌時可能需要根據不同抗氧化相關蛋白的表達情況進行預先篩選。

3.3 人參皂苷Rg3 還可以靶向腫瘤微環境抑制癌細胞 研究表明，腫瘤微環境在前列腺癌發生和發展中起重要作用，能夠促進癌細胞的增殖、遷移和免疫逃逸等行為；因此，腫瘤微環境可能是未來治療前列腺癌的重要靶標［12］。研究表明，人參皂苷Rg3 能夠對前列腺癌微環境中的間質細胞進行調節，抑制前列腺間質細胞的衰老，改變間質細胞旁分泌，進而抑制癌細胞的遷移［13］。由此可見，人參皂苷Rg3 既能作用于癌細胞本身，也能作用于腫瘤微環境，從而通過多種途徑和機制干預前列腺癌細胞的行為，但還需要體內實驗進一步證實。