甲狀旁腺激素對老年大鼠種植體骨結合的影響及機制研究

許東亮，彭朝暉

種植牙是修復各種牙齒缺失的主要手段之一，種植體的功能行使主要靠種植體初期的機械嵌合和種植遠期的骨結合［1］，種植體骨結合的成功與否受種植體材料、種植部位、種植手術、種植體外形設計等因素影響，頜骨以及全身的骨代謝狀況在種植體骨結合中也發揮重要作用［2-3］。骨密度和骨質量對種植體的成功具有重要意義，而年齡可影響骨密度和骨質量，隨著年齡增加，老年人群的骨密度和骨質量均低于青中年人群，因此年齡也是影響種植體骨結合的因素之一［4-5］。甲狀旁腺激素在骨組織代謝過程中具有促進骨吸收和骨形成雙重作用，甲狀旁腺激素可促進骨質疏松患者種植體骨結合的形成［6-7］。由于老年人群骨密度降低，甲狀旁腺激素是否可促進老年人群種植體骨結合及其機制尚需進一步研究。本研究對老年大鼠給予甲狀旁腺激素處理，觀察甲狀旁腺激素對種植體骨結合及堿性磷酸酶（ALP）、骨橋蛋白（OPN）、骨鈣素（OCN）、白細胞介素-6（IL-6）水平的影響，探討其可能作用機制，為臨床提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 清潔級健康雄性SD 大鼠48只，22月齡，體質量530～560 g；清潔級健康雄性SD大鼠24只，12月齡，體質量520～550 g，購自上海斯萊克動物公司，動物許可證號：SCXK（滬）2007-0005。所有動物在通風良好、濕度45%～50%、溫度24 ℃左右的環境下飼養。主要試劑和儀器：甲狀旁腺激素（中國上海吉爾生化有限公司，100 μg/支，批號：S110819-04），甲苯胺藍、多聚甲醛等（美國Sigma公司），骨組織RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒（日本Toyobo 公司），ALP、OPN、OCN、IL-6 PCR 引物序列由生工生物工程（上海）有限公司設計，種植鈦釘（韓國DIO protem implant system 公司，長6 mm，直徑2.5 mm），XR-36型雙能X線骨密度測量儀（美國Norland公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組 將48只22月齡老年大鼠根據隨機數字表法分為老年組和甲狀旁腺激素組，每組24只，將24只12月齡成年大鼠作為對照組。

1.2.2 3組大鼠種植術前骨密度測定 將3組大鼠適應性飼養1周后，采用雙能X 線骨密度測量儀測量上頜骨和脛骨骨密度。

1.2.3 種植體植入及甲狀旁腺激素給藥 3組大鼠測定骨密度后植入種植體，戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，在大鼠左側脛骨近中干骺段做長約3 cm 縱行切口，切開皮膚以及軟組織，在暴露骨面處用牙科電鉆制備種植窩，種植窩直徑2.5 mm，穿透對側骨皮質，將種植釘旋轉入種植窩，逐層縫合皮膚，術后青霉素肌內注射預防感染；甲狀旁腺激素組大鼠腹腔注射甲狀旁腺激素（20 μg/kg），隔天注射1 次［8］；對照組和老年組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，隔天1次，共8周。

1.2.4 標本制作 3組大鼠用藥結束后，每組取12只大鼠用多聚甲醛心臟灌注固定處死，將大鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，麻醉后仰臥位固定到動物手術臺上，剪開胸部皮膚、肌肉和胸骨，暴露心臟，剪開心包膜，暴露左心室，將灌注針頭刺入左心室，剪開右心耳，用注射器推注生理鹽水200～300 mL 至右心耳排出清亮液體，然后灌注多聚甲醛對組織進行固定。當大鼠抽動停止、僵硬后分離帶種植體脛骨用多聚甲醛固定，分離健側脛骨和上頜骨用乙醇固定，用于骨密度測定和制作骨組織磨片。每組取剩余12只大鼠麻醉處死，取種植體周圍骨組織用于測定ALP、OPN、OCN、IL-6 mRNA水平。

1.2.5 種植術后8周骨密度測定 將分離的健側脛骨和上頜骨用雙能X線骨密度測量儀測量骨密度。

1.2.6 帶種植體的骨組織磨片制作 將帶種植體的脛骨標本修剪成10 mm長的組織塊，乙醇脫水、二甲苯透明，樹脂包埋，采用硬組織切磨機制備帶種植體的骨組織磨片。

1.2.7 亞甲基藍-品紅染色 將上述制備的骨組織磨片加入亞甲基藍染液水浴（60 ℃）染色1 min，蒸餾水漂洗，加入堿性品紅染液染色5 min，干燥載片，中性樹膠封片，顯微鏡10×2倍下觀察亞甲基藍-品紅染色情況。紅染為骨小梁，藍染為纖維組織。

1.2.8 骨形態計量學參數測量 將帶種植體的組織磨片放置到光鏡下，采用微機彩色圖像分析系統和微機彩色病理圖像采集系統對骨組織形態計量學參數進行處理，測量參數包括：種植體骨結合率（BIC）、種植體周圍松質骨區骨量（TA）、骨皮質厚度（TCB）、骨小梁平均寬度（TW）、結合骨板寬度（CBLW），BIC=種植體與新生骨接觸部分面積/種植體總表面積×100%；TA=松質骨區種植體周圍骨小梁面積/松質骨區總面積×100%；TCB為原有皮質骨厚度的平均值；TW為松質骨區骨小梁直徑的平均值；CBLW為種植體和骨界面形成結合骨板厚度的平均值。

1.2.9 種植體周圍骨組織中ALP、OPN、OCN、IL-6 mRNA 水平測定 取種植體周圍骨組織100 mg，采用骨組織RNA 提取試劑盒提取種植體周圍骨組織總RNA，反轉錄試劑盒進行反轉錄。PCR引物序列見表1。采用熒光定量PCR試劑盒進行qPCR，以GAPDH 為內參照，檢測種植體周圍骨組織中ALP、OPN、OCN、IL-6 mRNA 水平，以 2-ΔΔCt表示 ALP、OPN、OCN、IL-6 mRNA水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0 軟件分析，計數資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，并進行方差齊性檢驗，組內多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

Tab.1 Primer sequence of PCR表1 PCR引物序列

2 結果

2.1 3 組大鼠種植前后骨密度比較 種植術前，與對照組比較，老年組和甲狀旁腺激素組大鼠上頜骨和脛骨骨密度均降低（P＜0.05）；老年組和甲狀旁腺激素組大鼠上頜骨和脛骨骨密度比較差異無統計學意義。種植術后8周，與對照組比較，老年組和甲狀旁腺激素組大鼠上頜骨和脛骨骨密度均降低（P＜0.05）；與老年組比較，甲狀旁腺激素組大鼠上頜骨和脛骨骨密度升高（P＜0.05）。見表2。

2.2 種植術后8 周3 組大鼠植骨區亞甲基藍-品紅染色比較 種植術后8 周時，對照組大鼠植骨區可見大量成熟的哈弗系統和成熟的板狀骨，結合骨板厚度增加，骨小梁密集；老年組大鼠植骨區見較多編織骨，可見成熟的板層骨，成熟的哈弗系統少，結合骨板薄，骨小梁稀疏；甲狀旁腺激素組大鼠植骨區染色情況介于對照組和老年組之間，見較多哈弗系統和成熟板層骨，編織骨比較少，結合骨板厚度較厚，骨小梁較密集，見圖1。

2.3 種植術后8周3組大鼠骨計量學指標比較 種植術后8周，與對照組比較，老年組和甲狀旁腺激素組大鼠 BIC、TA、TCB、TW、CBLW 值均降低（P＜0.05）；與老年組比較，甲狀旁腺激素組大鼠BIC、TA、TCB、TW、CBLW值均升高（P＜0.05）。見表3。

Tab.2 Comparison of bone mineral densities before and after implantation between three groups of rats表2 3組大鼠種植前后骨密度比較 （n=12，g/cm2，±s）

Tab.2 Comparison of bone mineral densities before and after implantation between three groups of rats表2 3組大鼠種植前后骨密度比較 （n=12，g/cm2，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與老年組比較，P＜0.05；表2、3同

組別對照組老年組甲狀旁腺激素組F種植前上頜骨骨密度0.152±0.011 0.135±0.009a 0.136±0.008a 12.316＊＊脛骨骨密度0.203±0.009 0.175±0.007a 0.173±0.008a 52.206＊＊種植8周后上頜骨骨密度0.151±0.010 0.129±0.008a 0.141±0.009ab 17.829＊＊脛骨骨密度0.198±0.011 0.168±0.010a 0.181±0.009ab 26.980＊＊

Fig.1 Toluidine blue staining of the bone grafting area 8 weeks after implantation in the three groups of rats(×20)圖1 種植術后8周3組大鼠植骨區亞甲基藍-品紅染色（×20）

Tab.3 Comparison of bone metrology indexes at 8 weeks after implantation between three groups of rats表3 種植術后8周3組大鼠骨計量學指標比較 （n=12，±s）

Tab.3 Comparison of bone metrology indexes at 8 weeks after implantation between three groups of rats表3 種植術后8周3組大鼠骨計量學指標比較 （n=12，±s）

組別對照組老年組甲狀旁腺激素組F BIC（%）76.58±4.35 55.47±4.12a 68.37±4.42ab 73.542＊＊TA（%）52.16±6.47 25.63±6.23a 47.72±5.78ab 63.718＊＊TCB（μm）273.81±7.57 232.14±7.04a 262.42±8.01ab 97.634＊＊TW（μm）93.24±8.52 41.27±8.36a 85.37±8.28ab 133.842＊＊CBLW（μm）58.73±6.45 41.25±6.12a 52.57±6.64ab 22.979＊＊

2.4 種植術后8 周3 組大鼠種植體周圍骨組織ALP、OPN、OCN、IL-6 mRNA水平比較 種植術后8周，與對照組比較，老年組和甲狀旁腺激素組大鼠種植體周圍骨組織ALP、OPN、OCN mRNA 水平均降低，IL-6 mRNA水平升高（P＜0.05）；與老年組比較，甲狀旁腺激素組大鼠種植體周圍骨組織ALP、OPN、OCN mRNA 水平均升高，IL-6 mRNA 水平降低（P＜0.05）。見表4。

Tab.4 Comparison of ALP,OPN,OCN and IL-6 mRNA levels in the bone tissues at 8 weeks after implantation between the three groups of rats表4 種植術后8周3組大鼠種植體周圍骨組織ALP、OPN、OCN、IL-6 mRNA水平比較 （n=12，±s）

Tab.4 Comparison of ALP,OPN,OCN and IL-6 mRNA levels in the bone tissues at 8 weeks after implantation between the three groups of rats表4 種植術后8周3組大鼠種植體周圍骨組織ALP、OPN、OCN、IL-6 mRNA水平比較 （n=12，±s）

組別對照組老年組甲狀旁腺激素組F ALP mRNA 1.00±0.03 0.34±0.05a 0.77±0.08ab 412.286＊＊OPN mRNA 1.00±0.02 0.30±0.04a 0.59±0.06ab 795.214＊＊OCN mRNA 1.00±0.02 0.45±0.05a 0.75±0.06ab 420.000＊＊IL-6 mRNA 1.00±0.04 2.18±0.11a 1.71±0.12ab 452.114＊＊

3 討論

種植體行使功能的基礎是種植體的骨結合，種植體成功與骨結合除了受種植體材料、外形、種植部位等因素影響外，也受頜骨和全身骨代謝狀況的影響；為了提高種植成功率，種植體的設計進行了各種優化，種植體的優化設計改善了種植體的骨結合能力和種植體的生物力學性能［9］，而對于頜骨骨量和骨質不良等患者自身因素對種植體帶來的不良影響仍在探索中。

骨密度和骨質量對頜骨種植體成功具有非常重要的作用，種植體植入頜骨皮質骨變薄、疏松多孔時，或植入骨小梁骨量減少的解剖部位時，種植手術失敗的風險顯著增高［10］；種植體植入部位骨量和種植失敗關系密切，骨密度越低、骨質量越差，骨整合越不好，種植體成功率越低［11-12］。頜骨骨量和骨質缺陷可減弱種植初期骨組織本身對種植體的支持，降低種植體初期的穩定性，延長種植體的骨愈合時間，對種植體的遠期骨結合造成不利影響，嚴重者可導致種植體松動、脫落，甚至種植失敗等［13-14］。

隨著人口的老齡化，老年牙列缺失人群增加，越來越多的老年患者選擇種植修復［15］。在人的一生中，骨組織一直處于不斷新陳代謝過程中，對于老年患者，人體的衰老過程影響骨代謝，骨密度、成骨細胞、骨基質、骨礦物質含量等都發生退行性變化［16］。骨代謝的兩個基本過程為骨吸收和骨形成，骨吸收相對增強和骨形成的相對減弱可導致骨質疏松的發生，骨代謝指標有骨形成指標和骨吸收指標，兩者反映整體骨轉換情況，骨轉換情況受年齡影響，隨著年齡增加，骨轉換減慢，骨量丟失［17-18］。本研究顯示，與成年大鼠比較，老年大鼠上頜骨和脛骨骨密度明顯降低；植骨區見較多編織骨，成熟的哈弗系統少，結合骨板薄，骨小梁稀疏，破骨細胞和成骨細胞多；BIC、TA、TCB、TW、CBLW 值降低，表明老年大鼠存在骨量丟失、骨密度下降，從而影響種植體骨結合的形成。

甲狀旁腺激素具有調節鈣磷代謝的重要作用，在骨質疏松的治療中被廣泛應用，在骨組織代謝過程中具有促進骨吸收和骨形成雙重作用，且研究發現甲狀旁腺激素對種植體骨結合具有促進作用［19］。在過高的甲狀旁腺激素濃度作用下，破骨細胞活性大于成骨細胞活性，導致骨丟失大于骨形成，造成骨分解；但間歇性、低劑量甲狀旁腺激素可促進處于增殖期的成骨細胞和前成骨基質細胞聚集，增加活化成骨細胞數量，從而促進骨形成［20］。ALP、OPN、OCN均為成骨標志基因：ALP為早期成骨標志，可促進細胞的成熟和鈣化，ALP 水平可反映成骨細胞分化水平；OCN為成骨細胞分泌蛋白，是骨組織特異性蛋白，可反映成骨細胞功能［21］。IL-6可刺激破骨細胞增殖和破骨細胞功能表達，抑制成骨細胞功能，是破骨細胞的主要調節因子［7］。研究發現甲狀旁腺激素可促進成骨相關基因OCN 和ALP 的表達發揮促進口腔種植體表面促成骨作用［22］。甲狀旁腺激素在骨質疏松中發揮重要作用，如陳煜東等［23］研究發現甲狀旁腺激素可升高骨質疏松性椎體壓縮骨折患者的25-羥維生素D 水平，降低Ⅰ型膠原羧基前肽和Ⅰ型前膠原氨基端前肽水平，提高骨密度，通過改善骨代謝、提高骨密度增加患者的康復效果；張澤華等［24］研究發現甲狀旁腺激素聯合骨髓間充質干細胞可通過改善骨密度代謝指標提高骨質疏松的治療效果。也有研究表明甲狀旁腺激素可促進骨質疏松大鼠種植體骨結合的形成［8］，老年患者普遍存在骨密度和骨質量低的現象，甲狀旁腺激素能否促進老年種植體骨結合形成尚不明確，本研究顯示，甲狀旁腺激素治療可提高老年大鼠上頜骨和脛骨骨密度，升高BIC、TA、TCB、TW、CBLW 值，升高種植體周圍骨組織ALP、OPN、OCN mRNA 水平，降低IL-6 mRNA水平，給予小劑量、間歇性甲狀旁腺激素治療后，可通過升高種植體周圍骨組織ALP、OPN、OCN mRNA水平和降低種植體周圍骨組織IL-6 mRNA 水平，促進成骨細胞功能，抑制破骨細胞增殖和功能，調節鈣磷代謝作用影響骨代謝，增加老年大鼠的骨密度，改善骨結構，增加結合骨板，增加松質骨區骨量和骨小梁寬度，升高種植體骨結合率，從而有效提高種植體骨結合質量。甲狀旁腺激素促進骨形成的機制可能與下列因素有關：甲狀旁腺激素可通過促進成骨細胞釋放多種生長因子，促進骨祖細胞增殖；通過刺激骨祖細胞分泌抗增殖素終止骨祖細胞增殖，從而促進骨祖細胞分化為前成骨細胞；通過抑制骨細胞表達硬骨素使骨襯里細胞轉換為成骨細胞，加快成骨速度；抑制成骨細胞凋亡、延長成骨細胞壽命，從而促進骨形成［25］。甲狀旁腺激素與骨質疏松關系密切，甲狀旁腺激素可通過提高骨密度、改善骨代謝指標改善骨質疏松相關疾病的治療效果，老年患者往往存在骨質疏松，從而影響骨形成，不利于種植體骨結合，給予甲狀旁腺激素治療后可通過改善患者骨質疏松狀態、提高骨密度、改善骨代謝指標，從而促進老年種植體骨結合質量。

綜上所述，老齡骨密度下降，影響種植體骨結合質量，給予小劑量、間歇性甲狀旁腺激素治療可通過提高種植體周圍骨組織成骨標志水平、降低破骨因子水平從而提高老年種植體骨結合質量。