膈肌呼出氣一氧化氮濃度、一氧化氮合酶表達水平及炎性因子水平與食管病變并慢性阻塞性肺疾病患者膈肌活動度的相關(guān)性研究

王慧，張鑫，薛乾隆，楊淼

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是因長期慢性氣道炎癥引起的氣道重塑、氣流受限性疾病，嚴重影響患者的肺功能及生活質(zhì)量。膈肌是人體重要的呼吸肌，由膈肌介導(dǎo)的呼吸功能占所有呼吸肌的60%～70%［1-2］。COPD患者需用力呼吸才能保證肺泡通氣量，但長期用力呼吸可增加膈肌負擔(dān)，導(dǎo)致膈肌疲勞，且膈肌機械位移范圍可隨肺過度充氣、肺容量增加而縮?。?-4］，進而導(dǎo)致膈肌活動度下降［5-6］。目前COPD患者膈肌活動度改變的潛在分子機制尚不完全明確。一氧化氮（NO）是由一氧化氮合酶（NOS）催化精氨酸生成的重要氣體信號分子。COPD患者氣道慢性炎癥可使NOS表達上調(diào)［7］、NO生成增多，而氣道NO既可刺激炎性細胞活化和浸潤、放大炎性反應(yīng)，又可啟動肌肉的興奮收縮耦聯(lián)、引起氣道平滑肌及膈肌過度收縮［8-9］。本研究旨在探討膈肌呼出氣一氧化氮（FeNO）濃度、NOS表達水平及炎性因子水平與食管病變并COPD患者膈肌活動度的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年6月—2018年12月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院收治的食管病變行開胸手術(shù)患者48例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前完善肺功能及FeNO濃度檢查；（2）術(shù)中留取膈肌標(biāo)本；（3）近期未接受糖皮質(zhì)激素及β2-受體激動劑治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）胸廓畸形、脊柱畸形者；（2）合并肺間質(zhì)疾病、支氣管哮喘者；（3）合并自身免疫性疾病及肝腎功能異常者。根據(jù)術(shù)前是否合并COPD將所有患者分為對照組（未合并COPD，n=26）和COPD組（合并COPD，n=22）。對照組患者中男16例，女10例；年齡51～69歲，平均年齡（59.9±8.6）歲；體質(zhì)指數(shù)（22.08±3.77）kg/m2；吸煙史10例；合并癥：高血壓13例，糖尿病9例；實驗室檢查指標(biāo)：血肌酐（70.14±10.77）mmol/L，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）（22.93±5.95）U/L，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）（21.25±7.14）U/L，pH值（7.41±0.89）；左心室射血分數(shù)（LVEF）（64.58±9.34）%。COPD組患者中男14例，女8例；年齡52～71歲，平均年齡（60.3±8.2）歲；體質(zhì)指數(shù)（21.61±3.42）kg/m2；吸煙史11例；合并癥：高血壓12例，糖尿病8例；實驗室檢查指標(biāo)：血肌酐（72.38±9.93）mmol/L，ALT（24.12±5.23）U/L，AST（21.93±4.58）U/L，pH 值（7.37±0.95）；LVEF（65.24±9.97）%。兩組患者性別（χ2=0.022）、年齡（t=0.164）、體質(zhì)指數(shù)（t=0.449）、吸煙率（χ2=0.645）、高血壓發(fā)生率（χ2=0.099）、糖尿病發(fā)生率（χ2=0.016）、血肌酐（t=0.744）、ALT（t=0.729）、AST（t=0.384）、pH值（t=0.150）、LVEF（t=0.237）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：20150012），患者及家屬對本研究知情。

1.2 主要儀器及試劑 主要儀器：肺功能儀購自德國耶格公司，F(xiàn)eNO測定系統(tǒng)購自瑞典尼爾斯公司；主要試劑：超純RNA提取試劑盒、SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture試劑盒均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，蛋白裂解液購自Invitrogen公司，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）的第一抗體均購自Abcam公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 膈肌活動度 比較兩組患者膈肌活動度。檢查膈肌時，患者取仰臥位，將探頭置于患者右肋下緣、腋前線與鎖骨中線中點處，方向指向右肩部，獲取清晰的膈肌圖像后記錄患者在呼吸運動過程中膈肌超聲信號的波峰與波谷，根據(jù)波峰與波谷計算膈肌活動度。

1.3.2 FeNO濃度 術(shù)前采用FeNO測定系統(tǒng)檢測兩組患者膈肌FeNO濃度，采用過濾器吸入外源性NO至最大肺活量后指導(dǎo)患者以50 ml/s的氣流速度呼氣，呼氣壓力為10～20 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa），F(xiàn)eNO測定系統(tǒng)可自動計算結(jié)果。本研究所使用的FeNO測定系統(tǒng)具備全面質(zhì)量控制功能：當(dāng)患者在測定過程中出現(xiàn)呼吸過弱或過強、漏氣、咳嗽和逆向呼或吸等情況時，系統(tǒng)主機可自動強行終止測定。

1.3.3 膈肌NOS mRNA相對表達量 比較兩組患者膈肌NOS（包括iNOS、eNOS、nNOS）mRNA相對表達量。術(shù)中，取患者膈肌組織適量，采用超純RNA提取試劑盒分離、提取組織總RNA，以RNA為模板，采用SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA合成cDNA，取cDNA；按照UltraSYBR Mixture試劑盒配置聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）反應(yīng)體系，按照95 ℃ 10 s、特異性退火溫度15 s、72 ℃ 25 s的程序反應(yīng)進行40個循環(huán)，儀器上可顯示PCR循環(huán)曲線及循環(huán)閾值，根據(jù)循環(huán)閾值計算iNOS、eNOS、nNOS的mRNA相對表達量?；蛞镄蛄屑疤禺愋酝嘶饻囟纫姳?。

表1 iNOS、eNOS、nNOS引物序列及特異性退火溫度Table 1 Primer sequence and specific annealing temperature of iNOS，eNOS and nNOS

1.3.4 膈肌NOS蛋白相對表達量 比較兩組患者膈肌NOS蛋白相對表達量。取膈肌組織適量，采用蛋白裂解液提取組織總蛋白，蛋白樣本經(jīng)加熱、變性后加入聚丙烯酰胺分離凝膠，采用電泳技術(shù)將蛋白樣本分離、電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜，將NC膜放入5%脫脂牛奶中封閉2 h，洗膜后在4 ℃環(huán)境中孵育iNOS、eNOS、nNOS的第一抗體過夜；第2天，洗膜后室溫孵育第二抗體2 h，再次洗膜并采用ECL顯影系統(tǒng)顯示蛋白條帶，以目的基因（iNOS、eNOS、nNOS）蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參基因β-actin蛋白的灰度值比值為目的蛋白相對表達量。

1.3.5 膈肌炎性因子 比較兩組患者膈肌炎性因子〔包括腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）〕水平。取膈肌組織適量，加入磷酸鹽緩沖液后進行超聲勻漿，將勻漿液在4 ℃離心機中以12 000 r/min離心20 min（離心半徑5.5 cm），取上清液，采用ELISA檢測患者上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以（x± s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料分析采用χ2檢驗；膈肌FeNO濃度、NOS表達水平及炎性因子水平與食管病變并COPD患者膈肌活動度的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膈肌活動度 COPD組患者膈肌活動度為（2.74±0.52）cm，小于對照組的（3.89±0.67）cm，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.549，P＜0.05）。

2.2 膈肌FeNO濃度 COPD組患者膈肌FeNO濃度為（37.42±6.23）ppb，高于對照組的（14.52±2.77）ppb，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=16.896，P＜0.05）。

2.3 膈肌NOS mRNA及蛋白相對表達量 COPD組患者膈肌iNOS、eNOS mRNA及蛋白相對表達量高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩組患者膈肌nNOS mRNA及蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表2～3、圖1）。

2.4 膈肌炎性因子水平 COPD組患者膈肌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表4）。

2.5 相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，膈肌FeNO濃度、iNOS mRNA相對表達量、eNOS mRNA相對表達量、iNOS蛋白相對表達量、eNOS蛋白相對表達量及TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平均與食管病變并COPD患者膈肌活動度呈負相關(guān)（P＜0.05，見表5）。

圖1 兩組患者膈肌NOS蛋白電泳結(jié)果Figure 1 Electrophoretic results of NOS protein in diaphragm in the two groups

表2 兩組患者膈肌NOS mRNA相對表達量比較（x±s）Table 2 Comparison of relative expression quantity of NOS mRNA in diaphragm between the two groups

表3 兩組患者膈肌NOS蛋白相對表達量比較（x±s）Table 3 Comparison of relative expression quantity of NOS protein in diaphragm between the two groups

表4 兩組患者膈肌炎性因子水平比較（x±s）Table 4 Comparison of levels of inflammatory cytokines in diaphragm in between the two groups

表5 膈肌FeNO濃度、NOS表達水平及炎性因子水平與食管病變并COPD患者膈肌活動度的Pearson相關(guān)分析結(jié)果Table 5 Pearson correlation analysis of FeNO concentration，expression of NOS and levels of inflammatory cytokines in diaphragm with diaphragm mobility in esophageal lesion patients complicated with COPD

3 討論

COPD是以不可逆氣流受限為主要特征的肺部疾病，氣流受限導(dǎo)致呼吸肌做功增加，患者需通過用力呼吸而保證肺泡足夠的通氣量，但長期用力呼吸會引起呼吸肌疲勞甚至損傷［10］。膈肌是人體重要的呼吸肌，也是COPD較易累及的呼吸肌，有研究報道，COPD患者膈肌肌纖維縮短約40%，而肋間肌肌纖維縮短約7%［11］，膈肌疲勞或受損可使肌動蛋白肌絲、肌球蛋白肌絲過度重疊，進而導(dǎo)致患者膈肌活動度下降；此外，COPD患者肺過度充氣、殘氣過多均會直接造成膈肌機械位移，進而加劇膈肌活動度下降［12-13］。本研究結(jié)果顯示，COPD組患者膈肌活動度小于對照組，提示COPD患者膈肌活動度下降，與劉岷等［6］研究結(jié)果一致。

相關(guān)研究表明，膈肌收縮功能損傷除與鈣離子釋放介導(dǎo)的興奮收縮耦聯(lián)異常有關(guān)外，還與肌細胞損傷有關(guān)［14］。氣道慢性炎癥是COPD患者的基本病理特征，而FeNO是臨床評價氣道炎癥的常用無創(chuàng)指標(biāo)［15］。NO是人體重要的氣體信號分子，可招募炎性因子、放大炎性反應(yīng)，造成氣道平滑肌、膈肌損傷；另外，NO還可通過影響自由基生成、電子鏈傳遞等過程而破壞興奮收縮［16-17］。本研究結(jié)果顯示，COPD組患者膈肌FeNO濃度高于對照組，且膈肌FeNO濃度與食管病變并COPD患者膈肌活動度與呈負相關(guān)，與既往研究結(jié)果一致［18-19］，提示COPD患者氣道內(nèi)大量生成的FeNO可通過直接損傷膈肌及興奮-收縮耦聯(lián)等使食管病變并COPD患者膈肌活動度下降。

NOS包括iNOS、eNOS、nNOS，可通過催化精氨酸代謝生成NO。張運濤等［7］研究表明，COPD患者膈肌NOS mRNA表達水平升高，但并分析不同類型NOS表達水平。本研究結(jié)果顯示，COPD組患者膈肌iNOS、eNOS mRNA及蛋白相對表達量高于對照組，但兩組患者nNOS mRNA及蛋白相對表達量間無統(tǒng)計學(xué)差異，提示iNOS、eNOS可能參與了食管病變并COPD患者膈肌損傷過程。呼吸肌長期過度做功、慢性炎癥均可誘導(dǎo)iNOS表達；eNOS與膈肌中內(nèi)皮細胞功能障礙、毛細血管重構(gòu)關(guān)系密切。本研究結(jié)果還顯示，膈肌iNOS mRNA相對表達量、eNOS mRNA相對表達量、iNOS蛋白相對表達量、eNOS蛋白相對表達量與食管病變并COPD患者膈肌活動度均呈負相關(guān)，提示膈肌iNOS、eNOS表達水平升高可能是導(dǎo)致食管病變并COPD患者膈肌活動度下降的機制之一。

氣體信號分子NO具有促炎活性，可通過激活炎性反應(yīng)而加重膈肌損傷、導(dǎo)致膈肌活動度下降［16-17］。TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8是由NO調(diào)控的常見促炎因子［20-22］。本研究結(jié)果顯示，COPD組患者膈肌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平高于對照組，提示COPD患者膈肌存在炎性反應(yīng)；進一步行Pearson相關(guān)分析顯示，膈肌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平均與食管病變并COPD患者膈肌活動度呈負相關(guān)，提示膈肌炎性因子水平升高與食管病變并COPD患者膈肌活動度下降有關(guān)。

綜上所述，膈肌FeNO濃度、iNOS及eNOS表達水平、炎性因子水平升高與食管病變并COPD患者膈肌活動度下降有關(guān)；但本研究僅進行了相關(guān)性分析，并不能證實膈肌FeNO濃度、iNOS及eNOS表達水平、炎性因子水平升高與食管病變并COPD患者膈肌活動度下降之間的因果關(guān)系，今后可結(jié)合動物實驗進一步驗證。

作者貢獻：王慧進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，研究的實施與可行性分析；張鑫、薛乾隆進行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；楊淼進行結(jié)果分析與解釋，論文的修訂；王慧負責(zé)撰寫論文，負責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。