利用ISSR標記鑒定雙孢蘑菇的傳統菌株類型

施肖堃 郭仲杰 蔡志欣 盧園萍 陳美元廖劍華

（福建省農業科學院食用菌研究所，特色食用菌繁育與栽培國家地方聯合工程研究中心，福建 福州 350014）

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）是我國的大宗食用菌之一，近年全國雙孢蘑菇年產量達200萬噸以上，占世界年產量的一半左右，產值達200多億元人民幣[1]。近幾十年來歐美等發達國家的雙孢蘑菇生產都采用工廠化模式，配套以產量高、周期短的工廠化生產專用高產類型品種，產品多為鮮銷[2]。而我國數十年來都以農業方式生產為主，至今農業方式生產量約占總量的80%。產品除鮮銷外，部分加工成罐頭外銷。所用的品種以優質為主、兼顧高產，如本單位選育的As2796、W192系列品種[3,4]。

目前我國雙孢蘑菇品種創新改良主要采取傳統菌株間雜交和野生種質與傳統或商業菌株間雜交。傳統菌株指未經雜交的早期栽培菌株，主要有優質和高產兩大類型，少數為中間類型。在栽培中優質類型菌株的優質特征明顯，其出菇較遲、產量較低、菌蓋圓整光滑、菌柄粗短、組織致密、菌褶細小色淡、不易褐變、制罐收縮率低。而高產類型品種則表現為出菇早、產量高且集中、菌蓋較平有鱗片、菌柄較長、菌褶大顏色較深、組織較松、制罐收縮率高。王澤生等根據雙孢蘑菇的栽培農藝特性，結合酯酶同工酶電泳分析，把雙孢蘑菇菌株的酯酶同工酶電泳表型區分為高產型（H型）、優質型（G型）、中間型（HG1-2型）、同核不育型（S型）和雜交型（HG4-5型）等[5,6]，其中傳統菌株以H型和G型為主，少量為HG1-2型。通過高產型（H型）和優質型（G型）傳統菌株之間的雜交，不斷獲得兼具優質和高產性狀的雙孢蘑菇新品種，對于我國雙孢蘑菇主栽品種的更新換代至關重要。

在雙孢蘑菇育種技術上，國內外目前都以雜交育種為主，國內以福建省農業科學院食用菌研究所的同工酶結合DNA分子標記輔助雜交育種為主導技術。上世紀90年代以后國內外多家單位采取DNA分子標記輔助育種技術，在親緣關系分析、雜交親本選擇、同核體鑒定等方面都得到一定的應用[7～10]。但在關鍵農藝性狀如產量、質量、抗病、抗逆等方面的分析卻鮮有成功的報道。

ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat，簡單序列重復區間）是一種基于微衛星序列發展起來的DNA分子標記技術[11]。它利用人工設計合成的核苷酸重復序列引物對SSR（Simple Sequence Repeat，簡單序列重復）之間的DNA序列進行半隨機PCR擴增，以獲得豐富的多態性。其已被應用于食用菌的遺傳圖譜構建、遺傳多樣性分析、基因定位、種質鑒定、遺傳變異分析等方面[8,10,12～14]。本研究利用ISSR技術對雙孢蘑菇不同類型的傳統菌株進行擴增，以期找到可以早期鑒別菌株優質或高產特性的DNA標記，輔助雜交育種。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）菌株。雙孢蘑菇48個傳統非雜交栽培菌株（24個優質類型，24個高產類型）收集自世界各地，包括來自歐洲、美國的菌株，以及由福建省農業科學院食用菌研究所保藏的國內保留、分離的早期引進或改良的栽培品種。其優質或高產類型已經過栽培評價和同工酶鑒定驗證（表1）。

（2）引物。用于本研究的19條ISSR引物序列同參考文獻[15]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，并由陳美元等在雙孢蘑菇分析中篩選獲得[8]。其中ISSR807、ISSR834、ISSR835、ISSR841序列分別為：5'-AG5'-AGAGAGAGAGAG AGAGT，AGAGAGAGAGAGAGYT，5'-AGAGAG AGAGAGAGAGYC，5'-GAGAGAGAGAGAG AGAYC（Y=C或T）。

表1 供試菌株編號及酯酶同工酶表型

1.2 方法

（1）菌株的培養。將供試菌株從試管接入液體PDB培養基中，恒溫24℃、轉速220 r/min振蕩培養2～3周。PDB培養基配制：200 g去皮馬鈴薯的煮出液，加20 g葡萄糖，用水定容至1 000 mL，pH自然。

（2）基因組DNA提取與檢測。使用OMEGA公司Fungus Genomic DNA Extraction Kit試劑盒，操作按說明書進行。提取的基因組DNA用Nanodrop微量核酸檢測儀檢測其濃度和雜質污染程度，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳（電壓5 V/cm）檢測其帶型及降解程度。

（3）ISSR-PCR。擴增體系、擴增條件及電泳檢測均同前[8]。

2 結果與分析

通過對雙孢蘑菇具有代表性的24個優質類型和24個高產類型傳統菌株的ISSR-PCR檢測，發現部分ISSR引物可以產生較為穩定的帶型。其中有的引物如ISSR841可以在菌株間產生較好的多態性（圖1），這些引物可用于指紋圖譜分析，形成菌株間的遺傳相似性聚類圖，可判斷菌株間的親緣關系。而引物ISSR834、ISSR835、ISSR807擴增產物在優質菌株之間或高產菌株之間帶型均較為一致，不產生明顯的多態性，但在優質和高產這兩大類型菌株之間的帶型卻不一致，產生了一條或數條可以區分優質傳統菌株和高產傳統菌株的標記條帶。

圖1 引物ISSR841對雙孢蘑菇48個不同類型菌株的ISSR擴增圖譜

圖2 引物ISSR834對雙孢蘑菇48個不同類型菌株的ISSR擴增圖譜

圖3 引物ISSR835對雙孢蘑菇48個不同類型菌株的ISSR擴增圖譜

引物ISSR834在優質類型菌株中擴增出3 000 bp、2 900 bp、600 bp的標記條帶，在高產類型菌株中擴增出3 500 bp特征條帶（圖2）；引物ISSR835在高產菌株中擴增出750 bp的特征條帶，而其他條帶在優質和高產類型菌株中同時存在（圖3）；引物ISSR807在優質菌株中擴增出680 bp特征條帶，而在高產類型菌株中擴增出1 000 bp特征條帶（圖4）。以上這些特異性標記條帶分別命名為ISSR834G3000、ISSR834G2900、ISSR834G600、ISSR834H3500、ISSR835H750、ISSR807G680、ISSR807H1000，它們分別產生于優質類型或高產類型傳統菌株，與雙孢蘑菇傳統菌株的優質或高產性狀緊密連鎖。經過驗證，這些標記條帶在傳統菌株中表現穩定，單獨或聯合應用這些標記條帶可以非常方便地區分和鑒定雙孢蘑菇傳統菌株的優質或高產性狀。

圖4 引物ISSR807對雙孢蘑菇48個不同類型菌株的ISSR擴增圖譜

3 結論與討論

我們通過大規模的ISSR引物篩選和大量的菌株驗證，找到了3個適用于雙孢蘑菇傳統菌株優質或高產性狀鑒定與預測的ISSR引物標記與方法。這些引物產生的7條特異性標記條帶與雙孢蘑菇的優質或高產性狀緊密連鎖，單獨或聯合利用擴增圖譜中的這些標記條帶便可在雙孢蘑菇雜交育種中快速地鑒定傳統菌株的優質或高產性狀，從而明確該傳統菌株是否為品種改良的重要親本來源，這對雙孢蘑菇定向雜交育種中親本類型的判別與選擇，提高育種效率具有重要的意義。

本單位多年來收集、保藏了近500份來自不同國家和地區的雙孢蘑菇栽培或野生菌株，其中有210多株為傳統栽培菌株[8]。通過本研究開發的ISSR標記，結合之前的栽培評價和同工酶鑒定等手段，這些傳統菌株的類型及親緣關系已經基本明確，并已應用于常規的雜交育種中。在國際上，荷蘭、美國、法國等較早開展雙孢蘑菇栽培與育種的國家仍保藏有大量的傳統菌株，本單位通過與這些國家相關研究機構的合作交流，不斷獲得一些新的傳統菌株。而本研究開發的ISSR特異標記條帶可用于第一時間鑒定新獲得的菌株類型，并與其他方式的評價結果相互驗證，保證入庫的新菌株獲得準確的類型記錄，方便日后雜交育種中的親本選擇。

此外，這些與優質或高產性狀緊密連鎖的標記條帶代表了哪些基因，以及這些基因與產、質量的相關性如何，也是值得進一步研究的課題。