利福平在耐藥結核分枝桿菌治療中的問題研究

趙梁

【摘要】 目的 分析利福平在耐藥結核分枝桿菌治療中的問題。方法130株結核分枝桿菌株， 其中20株結核分枝桿菌株對于乙胺丁醇、異煙肼、利福平和鏈霉素敏感， 2株H37Rv結核桿菌株，?64株對于劑量為250 μg/ml利福平表現出耐藥（R250）， 44株對于劑量為50 μg/ml利福平表現出耐藥（R50）， 均開展DNA序列分析。結果 在108株耐利福平結核分枝桿菌中， 發(fā)生rpoB基因突變92株（85.2%）， 250 μg/ml利福平表現出耐藥（R250）耐利福平結核分枝桿菌基因突變率78.1%明顯低于50 μg/ml利福平表現出耐藥（R50）耐利福平結核分枝桿菌的95.5%， 差異具有統計學意義（P<0.05）。R250耐利福平結核分枝桿菌基因位置主要以531密碼子為主， 突變率為58.0%（29/50）;基因位置在511密碼子突變率為16.0%（8/50）。R50耐利福平結核分枝桿菌基因突變位置主要以533密碼子為主， 突變率為23.9%（11/42）;其次基因位置在531、562密碼子， 突變率均為19.0%（8/42）。結論 絕大部分對于利福平耐藥的結核分枝桿菌均存在rpoB基因突變現象， 而對于利福平高耐藥結核分枝桿菌的rpoB基因之中， 主要突變特征為531位密碼子突變和多個密碼子聯合突變。其對于利福平低耐藥結核分枝桿菌的rpoB基因內突變位置呈現出了散在性分布現象。

【關鍵詞】 利福平;耐藥結核分枝桿菌;rpoB基因;基因突變

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.32.108

當前在治療結核疾病過程中， 結核分枝桿菌（MTB）高耐藥性問題已然成為了最近幾年結核疾病控制中的重要難題， 其也為結核病惡化的主要因素[1]。利福平為一類快速殺菌劑， 能夠明顯縮短結合疾病的治療療程， 其在短程化療中起到了相當重要的作用。另有研究表明， 結核分枝桿菌對于利福平耐藥代表病患的治療時間加長。倘若在此同時， 聯合使用其他抗結核藥物耐藥， 代表患者的治療效果較差。所以說， 結核分枝桿菌對于利福平耐藥機制一直是當前分枝桿菌研究的熱點話題。結合實際情況， 本文全面分析利福平在耐藥結核分枝桿菌治療中的問題， 現報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2017年1月～2018年1月本院收治的肺結核患者痰液內分離出130株結核分枝桿菌株作為研究對象， 其中有20株結核分枝桿菌株對于乙胺丁醇、異煙肼、利福平和鏈霉素敏感;2株H37Rv結核桿菌株;64株結核分枝桿菌株對于劑量為250 μg/ml利福平表現出耐藥（R250）;44株對于劑量為50 μg/ml利福平表現出耐藥（R50）。本實驗利用改良后的羅氏法進行細菌分離、培養(yǎng)、鑒定以及藥敏實驗。同時依照肺結核診斷細菌學規(guī)程完成各項工作。當細菌處于含量在50 μg/ml利福平的利福平培養(yǎng)基中能夠生長就可判定為耐藥， 其在250 μg/ml利福平的利福平培養(yǎng)基中能夠生長則可視為高耐藥。本實驗所利用的H37Rv結核桿菌株由省結核病控制中心參比實驗室所提供。

1. 2 方法 ①提取DNA：利用相關方式提取好DNA之后， 將其放置于-20℃環(huán)境下保存， 以備使用。②聚合酶鏈式反應（PCR）：下游引物（rpoB2）為：5ACG TGA GCG TGC CGC GCT GGA3。上游引物（rpoB1）為：5AGG CGA TCA CAC CGC AGA CGT3。所擴增的DNA片段長度均為184 bp。實驗所使用的PCR檢測系統由華美公司所提供。③DNA序列分析：實驗使用VGI公司生產的自動測序儀， 開展相關工作， 試劑盒為配套產品。使用濃度為6%的聚丙烯酰胺凝膠開展電泳工作， 并自動識別， 判定結果。

1. 3 統計學方法 采用SPSS21.0統計學軟件處理數據。計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

20株（R0）對于異煙肼、利福平、乙胺丁醇和鏈霉素敏感的結核分枝桿菌以及2株H37Rv結核桿菌株沒有檢測出rpoB基因易感區(qū)存在突變現象。在108株耐利福平結核分枝桿菌中， 發(fā)生rpoB基因突變92株（85.2%）。其中R250耐利福平結核分枝桿菌基因突變50株（78.1%）;R50耐利福平結核分枝桿菌基因突變42株（95.5%）， R250耐利福平結核分枝桿菌基因突變率明顯低于R50耐利福平結核分枝桿菌， 差異具有統計學意義（P<0.05）。R250耐利福平結核分枝桿菌基因位置主要以531密碼子為主， 突變率為58.0%（29/50）;基因位置在511密碼子突變率為16.0%（8/50）。R50耐利福平結核分枝桿菌基因突變位置主要以533密碼子為主， 突變率為23.9%（11/42）;其次基因位置在531、562密碼子， 突變率均為19.0%（8/42）。R250耐利福平結核分枝桿菌菌株基因突變內共計10株出現多密碼子聯合突變， 在此其中涉及到511位亮氨酸共計8株（80.0%）。

3 討論

從rpoB基因突變和利福平最低抑菌濃度關系方面來看， 當前臨床開展結核分枝桿菌藥敏實驗中[1]， 一般使用絕對濃度法予以進行。全面分析分枝桿菌是否出現耐藥現象。世界衛(wèi)生組織規(guī)定細菌在含量于40～50 μg/ml利福平培養(yǎng)基中能夠生長， 可以判定為耐藥。從我國來講， 臨床中判定利福平耐藥。情況一般采用兩個濃度， 詳細為50 μg/ml以及250 μg/ml。

其分別代表了低度耐藥以及高度耐藥。最低抑菌濃度（MIC）主要指的是：細菌在內含藥物的培養(yǎng)基中無法生長最低藥物濃度水平， 其為判定細菌耐藥水平的精準化指標[2]。本實驗對于結核分枝桿菌菌株rpoB基因突變區(qū)開展DNA序列分析， 結果證實：20株對于異煙肼、利福平、乙胺丁醇和鏈霉素敏感的結核分枝桿菌以及2株H37Rv結核桿菌株中沒有檢測出rpoB基因突變區(qū)域改變。108株對于耐利福平低耐藥和耐利福平高耐藥結核分枝桿菌菌株內共計92株存在rpoB基因核心區(qū)域點突變現象， 其和我國相關報道類似?；蛲蛔兊念l次和耐藥程度不存在關聯性[3， 4]。531位氨基酸突變?yōu)橹袊Y核分枝桿菌和利福平耐藥有關的最常見突變類型。其也為高耐藥結核分枝桿菌rpoB基因主要突變位點。本實驗中50株R250耐利福平結核分枝桿菌基因位置主要以531密碼子為主;42株R50耐利福平結核分枝桿菌基因突變位置主要以533密碼子為多， 其次為531、562密碼子， 僅有8株內含531位密碼子突變。由此能夠發(fā)現， 531位氨基酸突變位是利福平高耐藥結核分枝桿菌主要突變特征。

結核分枝桿菌出現耐藥性的主要方式為染色體突變所見的耐藥性[5-7]。因為把基因核苷酸出現突變， 進而形成了不正確的氨基酸序列。這在一定程度上對藥物以及靶位酶親和性造成影響， 進而形成了結核分枝桿菌對于藥物敏感性耐受或下降。細菌對利福平藥物產生耐藥主要形式為點突變， 而對于利福平高耐藥結核分枝桿菌株之中， 其更容易發(fā)生多個密碼子聯合突變[8， 9]。

綜上所述， 絕大部分對于利福平耐藥的結核分枝桿菌均存在rpoB基因突變現象， 而對于利福平高耐藥結核分枝桿菌的rpoB基因之中， 主要突變特征為531位密碼子突變和多個密碼子聯合突變。其對于利福平低耐藥結核分枝桿菌的rpoB基因內突變位置呈現出了散在性分布現象。

參考文獻

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[收稿日期：2019-04-01]