三七皂苷對SD 大鼠血小板聚集及人凝血酶時間影響的研究*

周紅輝 吳玉婷 趙恒 趙詩云

（1 江西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院 南昌330052；2 南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 江西南昌330006；3 江西省中醫(yī)藥研究院 南昌330046）

三七為常用中藥，化學(xué)成分包括三七皂苷類、黃酮、三七素、三七多糖、氨基酸、生物堿等多種生物活性物質(zhì)。其中三七皂苷的含量超過13%，是主要成分，具有較強(qiáng)的生物活性[1～2]。隨著藥物分析技術(shù)的進(jìn)步，現(xiàn)已從三七根、莖、葉、花及果實中分離出近百種皂苷類成分，由于成分在分子結(jié)構(gòu)上有微小差異，從而表現(xiàn)出不盡相同的藥理活性。研究表明三七總皂苷的功效具有多樣性和復(fù)雜性，其在臨床中的應(yīng)用范圍在不斷擴(kuò)大，臨床主要用于心血管疾病的治療，如腦路瘀阻、中風(fēng)偏癱、腦血管病后遺癥、冠心病、心絞痛等[3～4]。本研究觀察了三七總皂苷對SD 大鼠及人的血小板聚集、凝血功能的作用。現(xiàn)報道如下：

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 二磷酸腺苷（Adenosine Diphosphate, ADP），美國海倫娜公司，批號2-18-5366；血凝試劑為日本西森美康公司血凝儀原裝配套試劑，批號546954；AggRam 血小板聚集儀，型號：BJF52001，購于美國海倫娜公司；血凝儀，型號CS-5100，購于日本西森美康公司。

1.2 試驗藥物 三七皂苷（血塞通分散片，國藥準(zhǔn)字Z20050467）50 mg/片，批號DLB17-01。阿司匹林（Aspirin，國藥準(zhǔn)字J20130078），批號BJ16334。

1.3 試驗動物及分組 SD 雄性大鼠，SPF 級，體質(zhì)量260～280 g， 購于江西中醫(yī)藥大學(xué)，合格證號JZDWNo：000910。將SD 大鼠隨機(jī)分成五組，每組10 只，分別為三七皂苷給藥組：低、中、高劑量（150、300、600 mg/kg）；阿司匹林組：劑量60 mg/kg；對照組：等體積生理鹽水。

1.4 健康人抗凝全血標(biāo)本的制備 選取健康志愿者男女各5 人（45～60 歲），晨起空腹取血，每人10 ml，分別用3.8%枸櫞酸鈉溶液（體積比1:9）抗凝。將每份抗凝全血標(biāo)本分成5 等分，每份2.0 ml，總計50 份標(biāo)本。

1.5 方法

1.5.1 三七皂苷在大鼠體內(nèi)給藥對血小板聚集率的影響 SD 大鼠按照實驗分組，連續(xù)灌胃給藥4 d，第4 天過夜時禁食不禁水，第5 天照常灌胃給藥，2 h 后用10%的水合氯醛（3.0 ml/kg）麻醉，通過腹主動脈取新鮮全血，用3.8%枸櫞酸鈉溶液（體積比1:9）抗凝。參照尹小明等[5～6]所建立方法測定大鼠的血小板聚集率。取枸櫞酸鈉抗凝全血，分別以800 rpm及3 000 rpm 先后離心15 min，每次離心取上清，各得富血小板血漿（Platelet Rich Plasma,PRP）及貧血小板血漿（Platelet Poor Plasma,PPP）。PRP 血小板最終濃度以PPP 調(diào)整至合適范圍，取調(diào)整后的PRP 250 μl 置37℃保溫5 min 后，加入誘導(dǎo)劑ADP 溶液25 μl（5 μmol/L），立即以血小板聚集儀動態(tài)測量各實驗組的5 min 內(nèi)血小板最大聚集率（PAGmax），并計算各組給藥對血小板反應(yīng)的抑制率（IR）。IR 按公式計算[7～8]：IR=（對照組PAGmax－給藥組PAGmax）/對照組PAGmax×100%。

1.5.2 三七皂苷在人血體外給藥對ADP 誘導(dǎo)血小板聚集率的影響[7]取健康人抗凝全血標(biāo)本50 份，分為五組，每組10 份，分別為三七皂苷給藥組：低濃度0.25 mg/ml、中濃度0.50 mg/ml、高濃度1.00 mg/ml；阿司匹林組：0.3 mg/ml；對照組：等體積生理鹽水。按實驗分組分別加入不同劑量藥物到抗凝全血標(biāo)本中，并充分混勻（避免劇烈振搖），置37℃保溫2.0 h 后，接著將標(biāo)本離心分離血漿，并測定各實驗組5 min 內(nèi)血小板PAGmax和IR。

1.5.3 三七皂苷對人血體外凝血功能的影響[6]取健康人抗凝全血標(biāo)本50 份，分為五組，每組10 份，分別為三七皂苷給藥組：低濃度0.25 mg/ml、中濃度0.50 mg/ml、高濃度1.00 mg/ml；肝素組：0.25 U/ml；對照組：等體積生理鹽水。各實驗組加入不同劑量藥物經(jīng)37℃保溫作用2 h 后，離心分離血漿，用全自動CS-5100 血凝儀分別測定凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）和凝血酶時間（TT）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理，計量資料以s）表示，采用t 檢驗；計數(shù)資料用%表示，采用卡方檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三七皂苷在大鼠體內(nèi)給藥對血小板聚集率的影響 阿司匹林組及三七皂苷中、高劑量組5 min內(nèi)血小板PAGmax均顯著低于對照組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，阿司匹林組、三七皂苷中劑量組、三七皂苷高劑量組IR 分別為29.97%、34.60%、46.90%，且呈劑量依賴關(guān)系。見表1。

表1 三七皂苷對SD 大鼠體內(nèi)ADP 誘導(dǎo)血小板聚集率的影響（n＝10

表1 三七皂苷對SD 大鼠體內(nèi)ADP 誘導(dǎo)血小板聚集率的影響（n＝10

注：與對照組比較，#P＜0.05，*P＜0.01。

2.2 三七皂苷在人血體外給藥對血小板聚集率的影響 三七皂苷0.50、1.0 mg/ml 和阿司匹林0.30 mg/ml 時，血小板PAGmax均有不同程度降低，與對照組比較，具有顯著性差異（P＜0.01），三七皂苷中劑量組、三七皂苷高劑量組、阿司匹林組IR 分別為29.93%、52.64%、47.49%。見表2。

表2 三七皂苷在人血體外給藥對血小板聚集率的影響（n＝1

表2 三七皂苷在人血體外給藥對血小板聚集率的影響（n＝1

注：與對照組比較，*P＜0.01。

2.3 三七皂苷在人血體外給藥對凝血功能的影響

三七皂苷給藥組人血體外PT、APTT、TT 與對照組比較時間有延長趨勢，但無顯著性差異。見表3。

表3 三七皂苷在人血體外給藥對凝血功能的影響（n＝10

表3 三七皂苷在人血體外給藥對凝血功能的影響（n＝10

注：與對照組比較，*P＜0.01。

3 討論

血小板聚集是血小板的主要功能之一，是病理性血栓形成和生理性止血的核心環(huán)節(jié)。有觀點表明三七皂苷的活血作用是通過降低血液黏度、改善纖溶活性、下調(diào)凝血因子及抗血小板聚集等多種機(jī)制預(yù)防血栓形成[8]。Wang 等[9]提出三七皂苷抑制血小板與受損內(nèi)皮細(xì)胞（EC）的黏附作用可能是通過調(diào)節(jié)EC 和血小板中環(huán)氧化酶（COX）的途徑來實現(xiàn)的。進(jìn)一步的研究證實了這一機(jī)制，郭爽等[10]的研究表明，三七總皂苷與阿司匹林聯(lián)合應(yīng)用后的抗血小板凝集作用表現(xiàn)更顯著，三七總皂苷與阿司匹林相互之間具有協(xié)同和促進(jìn)作用，并且三七皂苷通過下調(diào)環(huán)氧化酶-1（COX-1）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）水平是其實現(xiàn)抗血小板凝集作用的途徑之一。另有研究表明，三七皂苷還可通過誘導(dǎo)過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）活化及其下游PI3K/Akt/eNOS 途徑抑制血小板聚集[11]。可見，三七皂苷抑制血小板聚集的途徑是多樣性的，是否存在其它潛在機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本實驗表明三七皂苷具有顯著的體內(nèi)外抗血小板聚集作用，并通過抑制血小板聚集作用來實現(xiàn)或加強(qiáng)其活血祛瘀，通脈活絡(luò)等功效。