色譜技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用

賀英 張嬌嬌 趙珺睿

天津紅日藥業(yè)股份有限公司 天津 3017 00

1 色譜技術(shù)概述

色譜分析是根據(jù)固定相和流動相分配系數(shù)的差異對物質(zhì)進(jìn)行分離和分析。在液相色譜、氣相色譜和超臨界液相色譜中都可以發(fā)現(xiàn)流動相的分子聚集狀態(tài)。根據(jù)分離原理可分為吸附、分布、空間封閉、離子交換、親和性色譜。按操作原理可分為柱層析法和平板層析法，色譜分析法已成為藥典中最常用的分析方法之一。根據(jù)實際情況，使用簡單、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)有效的儀器是必要的。隨著社會的發(fā)展，對不同藥物的檢測有很多不同的方法。不同的研究機構(gòu)或監(jiān)測部門有不同的檢測標(biāo)準(zhǔn)和要求。通過把高效液相色譜法與不同儀器相結(jié)合，使其能夠相互補充，進(jìn)而達(dá)到一致和實用的目的[1]。

2 常用色譜技術(shù)

2.1 高效液相色譜技術(shù)

在現(xiàn)代化學(xué)中，色譜法是一種廣泛應(yīng)用的以揮發(fā)性為主的分析分離技術(shù)。高效液相色譜法（HPLC）已成為一種更加實用有效的方法，其成為化學(xué)物質(zhì)分析和檢測的重要方法。盡管這一方法適用性強、效率高，但也不是萬能的，比如其檢測器靈敏度就不如氣相色譜，不能滿足對痕量物質(zhì)的分析，比如在藥物研發(fā)中對基因毒性雜質(zhì)的控制，單采用高效液相色譜法很難滿足檢測要求。另外其柱外效應(yīng)，容易使色譜峰變寬，降低分離效率。

2.2 毛細(xì)管電泳色譜技術(shù)

毛細(xì)管電泳色譜法是1980年初開發(fā)的一種分離技術(shù)，它將傳統(tǒng)的電泳技術(shù)與色譜法技術(shù)結(jié)合起來，具有操作方便、分離方法多樣性等優(yōu)勢?；驹瓌t是分離物質(zhì)分解成充電離子或粒子，并根據(jù)不同的運動或分布因素按電場的作用將其分離到毛細(xì)管中。近年來，毛細(xì)管電泳技術(shù)在醫(yī)療領(lǐng)域得到廣泛傳播和發(fā)展，許多國家利用毛細(xì)管電泳技術(shù)分離和測量藥物中的雜質(zhì)和異構(gòu)體[2]。

2.3 二維液相色譜技術(shù)

2.3.1 二維液相色譜技術(shù)概述

隨著現(xiàn)代藥學(xué)的發(fā)展，尤其是隨著生物技術(shù)的發(fā)展，一些復(fù)雜混合物的分離如分子肽和氨基酸等成分靠單一的色譜技術(shù)很難得到分離。二維液相色譜的出現(xiàn)，有效地促進(jìn)了現(xiàn)代藥學(xué)中復(fù)雜組分分離的進(jìn)一步發(fā)展，具有更高的分離效率。二維液相色譜（2D-LC）用于分析和檢測多種分離技術(shù)，通過把不同的色譜柱連接起來，從而使一級色譜中的非液相組在下一級二維色譜圖中能夠被分離出來。通過重復(fù)分離分析，直到所有部件分離。二維液相色譜是兩種分離方式的結(jié)合，是不同的一維液相色譜的結(jié)合，二維液相色譜可分為兩種模式：中心切割模式和二維液相色譜模式[3]。

2.3.2 二維液相色譜技術(shù)的模式

中心切割方式有選擇地將成分分為二維進(jìn)行分離和檢測，從而有效地減少外部干擾，提高分離純度。完全轉(zhuǎn)移到第二維度進(jìn)行分離。盡管存在干擾，但可獲得適用于復(fù)雜樣品分離和檢測的所有成分的進(jìn)一步信息。與一維分離檢測相比，這一檢測在極大程度上，能夠提升樣品分離的純度，進(jìn)而防止外界的干擾，簡化濃縮和清洗過程，降低樣品風(fēng)險。然而，分離檢測過程中的損失和污染仍然很大，因此更需要更換分離單元。

通常情況下，對于二維液相色譜而言，往往使用兩支或多支色譜柱，再者，根據(jù)柱結(jié)合技術(shù)，進(jìn)一步完成樣品的柱間切換。一般而言，柱切換分為部分和整體兩種。這種劃分主要是根據(jù)切割組分來進(jìn)行，根據(jù)其是否直接進(jìn)入二維中，然而，二維分離可分為離線和在線。對于以往的中心切割技術(shù)，首先是在容器中收集一維洗脫產(chǎn)物，然后進(jìn)樣到第二維中?，F(xiàn)階段，隨著社會的進(jìn)步以及經(jīng)濟(jì)水平的不斷提升，相應(yīng)的儀器也得到快速的發(fā)展，以便能夠有效適應(yīng)自動化分離的需要[4]。

2.4 液相色譜-核磁共振聯(lián)用技術(shù)

對于核磁共振而言，其獲得有機物詳細(xì)結(jié)構(gòu)信息的有力手段，在極大程度上，可以提供不同分子間的細(xì)微差別，然而，核磁共振主要是分析樣品是否為純物質(zhì)，如果對混合物加以研究，往往是比較有難度的?；谶@一現(xiàn)狀，在運用核磁共桭時，應(yīng)該對混合樣品進(jìn)行分離，以便達(dá)到顯著的效果。液相色譜-核磁共振技術(shù)始于上世紀(jì)80年代，是近年來才發(fā)展起來的一項技術(shù)。液相色譜-核磁共振技術(shù)主要應(yīng)用于然產(chǎn)物的分析及藥物的代謝研究，但其普及度不高，在實際運用中還存在著一些不足，比如NMR檢測靈敏度不夠高，液相色譜中流動相中的質(zhì)子對NMR的干擾等問題。相信今后隨著技術(shù)的發(fā)展，色譜-核磁共振連用技術(shù)會有質(zhì)的發(fā)展，在藥物分析領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用，通過參考文章《液相色譜-核磁共振連用技術(shù)發(fā)展?fàn)顩r》得出。

2.5 分子生物色譜技術(shù)

這一技術(shù)具有重現(xiàn)性好、分析速度快、具有藥理學(xué)意義等特點，適用于中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的篩選研究。

2.5.1 血漿蛋白

血漿蛋白能與藥物發(fā)生可逆結(jié)合成為“血漿蛋白-藥物復(fù)合物”，到達(dá)作用部位發(fā)生藥理作用。將血漿蛋白固載于載體上作為生物色譜填料，形成一種可以模擬體內(nèi)環(huán)境中藥物與血漿蛋白間相互作用的色譜系統(tǒng)，由于不同的藥物分子與血漿蛋白的結(jié)合率具有差異，它在固定相的保留行為也不同，結(jié)合色譜技術(shù)中的各種參數(shù)計算，一方面可以篩選中藥中的活性物質(zhì)，還能進(jìn)行藥物與血漿蛋白的作用關(guān)系的研究[6]。

2.5.2 受體類

受體是一類功能蛋白，是藥物發(fā)揮作用的主要靶點，通過受體特異性地識別、結(jié)合，通過信息傳導(dǎo)從而參與生理調(diào)控、神經(jīng)傳導(dǎo)等多種機體生理病理過程。若將受體固載于固定相表面，把其特異性結(jié)合作用與色譜分離技術(shù)結(jié)合，就能建立一種快速篩選藥效物質(zhì)的方法，在此色譜柱中可保留能與受體特異性結(jié)合的中藥活性組分，而無保留行為的物質(zhì)流出，活性篩選和色譜分離兩種模式可同時進(jìn)行?；诟哂H和力固定化受體的色譜法有望成為確認(rèn)藥物靶標(biāo)和藥物受體相互作用分析的替代方法。

2.5.3 DNA

DNA是很多藥物的作用靶點如抗菌、抗腫瘤、抗病毒等，藥物小分子可與DNA通過嵌插作用、溝槽結(jié)合、靜電結(jié)合、長距組裝等相結(jié)合，由于溝槽結(jié)合和嵌插不會影響DNA的結(jié)構(gòu)而影響其活性，因此DNA通過上述方式構(gòu)建MBC，以此篩選天然產(chǎn)物中的活性物質(zhì)。Su等以小牛胸腺DNA為固定相，作為一維色譜分離黃連、黃柏和苦參中的活性成分，而為二維色譜ODS柱色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)，對一維色譜的粗產(chǎn)物進(jìn)行分離分析鑒定，實現(xiàn)了中藥復(fù)雜樣品的高效分離和活性成分篩選鑒定一體化流程[7]。

3 結(jié)語

色譜技術(shù)在醫(yī)藥產(chǎn)品的檢測和分離中起著非常重要的作用。在藥品的實際檢測中，應(yīng)根據(jù)樣品的種類、純度要求和分離的需要，選擇合適的分離技術(shù)和類型[8]。