60Co-γ輻照紅參提取物對1型糖尿病小鼠的影響

齊 欣 崔承弼 - 金莉英 - 姜 欣 張 露

(延邊大學，吉林 延吉 133000)

糖尿病已被列為威脅人類健康的重大慢性疾病之一，而糖尿病患者多因體內胰島素分泌不足，不能有效地分解體內糖類物質，進而引發高血糖和尿糖等癥狀，多數患者還伴隨脂代謝紊亂等癥狀，主要表現為血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)增高的高脂血癥，糖尿病的出現會導致多種并發癥，并難以控制，最終導致糖尿病患者病情進一步惡化[1]。近年來糖尿病已成為繼癌癥、心腦血管疾病后的第三類人類健康殺手。針對糖尿病，臨床治療手段主要還是通過藥物、運動和飲食來控制其發展惡化[2]，截至目前仍未出現針對糖尿病迅速或徹底的治療手段，常規西醫主要通過補充胰島素、增強胰島素受體敏感性、減輕胰島素抵抗作用和增強β細胞分泌、提升機體血糖耐受等途徑來緩解糖尿病病情。但存在一定的副作用，可能造成乳酸中毒、肝細胞損傷、神經退行性病變、消化道不適及嚴重的低血糖等，甚至死亡，所以亟需更天然的治療藥物，如人參等天然藥材[3-5]。

人參為五加科人參屬多年生草本植物的根莖，是享譽華夏的千年古藥。其具有多種祛病養生的生理功效，素有“百草之王”之美譽。隨著其有效成分和藥理病理活性與功能的不斷研究，越來越多的專家學者[6-9]發現人參能夠緩解糖尿病癥狀，具備輔助治療糖尿病的巨大潛力。人參中具有多種對人體有益的活性成分，但其在儲存和加工過程中易受微生物污染，因此需對其進行無菌處理。傳統滅菌方法，如熱處理和化學熏蒸法等會對環境和人體造成危害，而輻照技術應用范圍廣，相比傳統滅菌方法，其殺菌效率高，并且節能、省時、成本低[10]。

60Co-γ射線輻照滅菌法，其穿透力極強，滅菌效果好，近年來在中藥滅菌中得到越來越廣泛的應用[11]。前期試驗[12-13]發現，經15 kGy劑量的60Co-γ射線輻照，紅參中降血糖相關人參皂苷Rh4和CK含量提升最顯著，其中人參皂苷Rh4比未輻照前提升了74.89%，同時CK含量提升了59.42%。同時輻照處理也能提升人參的殺菌和貯藏效果[14]。試驗擬以經15 kGy60Co-γ射線輻照紅參和未輻照紅參為研究對象，采用50%乙醇提取其活性成分并對1型糖尿病小鼠進行體內試驗，研究15 kGy60Co-γ射線輻照紅參和未輻照紅參提取物對于糖尿病小鼠在血糖、血脂及糖化血紅蛋白方面的改善能力，為輻照紅參提取物在預防糖尿病方面的開發與利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物：體重為20～30 g的清潔級雄性昆明種小鼠，于適宜條件飼養，適應性喂養7 d后進行后續試驗，延邊大學動物實驗中心。

1.2 試驗材料及儀器

1.2.1 試驗材料

小鼠飼料(配料表見表1)：延邊大學動物實驗中心；

紅參：2016年產，長白山科學研究院提供，于四川省原子能研究院進行輻照處理；

鏈脲佐菌素：美國Sigma公司；

鹽酸二甲雙胍：河北山姆士藥業有限公司；

檸檬酸、檸檬酸鈉：AR級，天津市華東試劑廠；

表1 小鼠飼料配料表?[3]

? 能量16 857 kJ/kg。

總膽固醇(T-CHO)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、糖化血紅蛋白(HbAlc)試劑盒：南京建成生物工程研究所；

醫用酒精：上海金和實業有限公司；

正丁醇：AR級，天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2.2 試驗儀器

高速離心機：8O-2型，上海手術器械廠；

離心機：TG16A-WS型，上海盧湘儀器有限公司；

數控超聲波清洗器：KQ3200DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

旋轉蒸發儀：SB-2000型，上海愛郎儀器有限公司；

分析天平：FA2004型，上海上平儀器有限公司；

立式鼓風干燥箱：DHG-9620A型，上海百典儀器設備有限公司；

血糖儀：AG-605型，天津九安醫療電子股份有限公司；

多功能熒光酶標儀：SP-Max3500FL型，上海閃譜生物科技有限公司；

電熱恒溫培養箱：DNP-9082型，上海精宏實驗設備有限公司；

電子天平：Scout SE-SE202FZH型，奧豪斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅參提取物的制備 紅參樣品粉碎過80目篩后，以50%乙醇溶液按料液比1∶10 (g/mL)提取3次，40 kHz 超聲提取3次，每次60 min，合并3次上清液，烘箱中80 ℃過夜后旋轉蒸發至干，蒸餾水溶解后，以60 mL 水飽和正丁醇于分液漏斗多次萃取至上層有機層澄清，并合并上層旋轉蒸發至干后以少量蒸餾水溶解置于-80 ℃冷凍后凍干得紅參提取物。

1.3.2 血糖含量的測定 小鼠隔夜禁食12 h后(21時～次日9時)，進行剪尾取血，棄去第1滴尾尖血后檢測血糖值，并記錄。

1.3.3 糖尿病小鼠建模

(1) 將1.1中的小鼠在動物飼養室適應性喂養7 d后，隨機選取6只作為空白試驗組，對所有小鼠禁食處理，禁食方法為隔夜禁食不禁水12 h(21時～次日9時)。

(2) 測量并記錄小鼠禁食體重及空腹血糖水平后，建立1型糖尿病模型，STZ濃度為12 mg/mL，空白組同時腹腔注射緩沖溶液做假性處理。

(3) 建模7 d后對各組小鼠禁食，空腹時稱量體重，并測其空腹血糖值，建模成功標準：建模7 d后，小鼠空腹血糖值>11.1 mmol/L (200 mg/dL)，剔除建模失敗小鼠。

1.3.4 受試物劑量設計 將血糖值>11.1 mmol/L(200 mg/dL)的小鼠隨機分為6組，將輻照紅參與未輻照紅參提取物按表2中劑量配置，其中輻照人參提取物劑量依據預試驗結果進行設置，分組和劑量設置見表2。

連續灌胃30 d，ⅰ、ⅱ組灌胃相同體積的蒸餾水，末次灌胃后進行眼球取血并脫頸處死，隨后進行解剖。

1.3.5 小鼠全血HbAlc和血清TC、TG的測定 各組小鼠最后一次灌胃后進行眼球取血，處死并收集血漿至1.5 mL 離心管中，按照相應試劑盒使用方法，用酶標儀在固定波長下檢測相應的吸光值，分別計算TC、TG和HbAlc含量。

表2 分組及劑量設置

2 結果與討論

2.1 紅參提取物對小鼠飲食及食物效價的影響

建模后，經過連續30 d灌胃試驗后發現，試驗組小鼠隨著灌胃時間的延長，毛發由枯黃干燥變得濃密順滑；ⅰ組小鼠在攝食量與攝水量上均無異常變化，模型組小鼠攝食量隨著灌胃時間的延長呈現下降的趨勢，其中與ⅱ組相比，α、λ和ⅲ組攝食量與攝水量明顯減少，其食物利用率也明顯提升，但α組數值更接近ⅲ組。由此可知，經紅參提取物灌胃后均可有效改善小鼠狀態，提高體重增量，提高食物效價。

表3 試驗期間各組小鼠體重及攝食飲水情況?

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 紅參皂苷提取物對各試驗組小鼠體重及血糖的影響

由圖1可知，ⅰ組小鼠在飼養期間體重整體呈上升趨勢，且體重增幅均遠遠超過其他各試驗組；ⅱ組小鼠在灌胃期間體重呈不增長或負增長；ⅲ組和α、β、γ、λ組小鼠體重增降趨勢基本一致，α組小鼠體重增幅僅次于ⅲ組，均優于其他各試驗組，λ組小鼠體重增加量略高于β、γ組，而β組體重增幅又略高于γ組。說明在試驗劑量范圍內隨劑量的增加，能夠有效提高1型糖尿病小鼠的體重，且輻照人參高劑量組在改善小鼠體重方面好于未輻照人參高劑量組。

由表4可知，隨著試驗的進行，ⅰ組血糖水平略有升高，但保持在正常血糖范圍內，ⅱ組血糖呈明顯上升趨勢，ⅲ組血糖水平呈先上升后下降的趨勢，輻照人參提取物α、β、γ組和未輻照人參提取物λ組與ⅲ組趨勢相同。第14天時，其余各組血糖水平均顯著高于ⅰ組(P<0.05)；第24天時，其余各組血糖水平也均顯著高于ⅰ組(P<0.05)，ⅱ組顯著高于ⅲ組和α、β、γ、λ組(P<0.05)，α組顯著低于β、γ、λ組(P<0.05)。說明二甲雙胍陽性藥和α、β、γ、λ組提取物懸濁液均對糖尿病小鼠的血糖上升有一定的緩解作用，且α組的降血糖效果優于λ組。第33天，ⅲ組仍顯著高于ⅰ組(P<0.05)，同時ⅲ組顯著低于α、β、γ、λ組(P<0.05)，α和λ組無顯著差異(P>0.05)，但從空腹血糖值來看α組更接近ⅲ組。第43天時，ⅲ組與ⅰ組無顯著差異(P>0.05)，α組和λ組無顯著差異(P>0.05)，但從空腹血糖值來看仍是α組更接近ⅲ組。說明陽性對照組小鼠血糖值已基本恢復正常值，輻照高劑量組降血糖效果優于未輻照高劑量組。可見，輻照紅參提取物能夠起到降低糖尿病小鼠血糖的作用，并且輻照后的紅參提取物好于未輻照的。

圖1 輻照與未輻照紅參提取物對各試驗組小鼠體重的影響

Figure 1 Effects of irradiated and non-irradiated red ginseng extract on body weight of mice (n=6)

表4 試驗各組小鼠血糖變化?

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 紅參皂苷提取物對小鼠血液相關指標的影響

由表5可知，從血清TC含量來看，ⅱ組顯著高于ⅰ組和其余各組(P<0.05)，α組和ⅲ組無顯著差異(P>0.05)，且α組顯著低于λ組(P<0.05)。說明輻照紅參高劑量組與未輻照紅參高劑量組相比，在降低糖尿病小鼠血清TC含量的效果上更接近于二甲雙胍。從血清TG含量來看，α組和ⅲ組無顯著差異(P>0.05)，α組與λ組無顯著差異(P>0.05)，但從TG含量來看，α組更接近于ⅲ組。說明輻照紅參高劑量組降低糖尿病小鼠血清TG含量的效果更好。從糖化血紅蛋白測定結果來看，α組和λ組測定結果較接近于ⅲ組，說明這兩組小鼠的血糖控制情況較好。胰島素的缺乏會導致攝入的脂肪等不能被人體利用，并且機體中的某些大分子物質，如脂肪分解的產物，游離脂肪酸進入肝臟，會生成甘油三酯和酮體，而脂肪組織中脂類的溶解使甘油三酯(TG)水平上升、同時由于高密度脂蛋白(HDL)水平的降低，從周圍組織攝取膽固醇的能力降低，使機體膽固醇聚集水平升高，總膽固醇(TC)水平上升，而經輻照紅參提取物灌胃后能夠較好地改善TC、TG以及Hablc的水平。

表5 紅參提取物對HbAlc、TC、TG的影響?

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 紅參皂苷提取物對小鼠臟器系數的影響

臟器系數(臟體比)指機體某臟器質量占體重的百分比。正常生長發育下的同一物種其機體各臟器與體重的比值較恒定。而在動物染毒或存在病理缺陷時，臟器發生氧化損傷或水腫、增生等，臟體比相應增大或減小，臟器系數隨之改變，由此可來判斷小鼠的健康狀況。根據表6可知，各組間心臟臟器系數除ⅱ組顯著升高(P<0.05)；肝臟臟器系數ⅱ組顯著升高而經過不同劑量受試物干預后肝臟增生肥大情況得到顯著改善(P<0.05)，其中α組和λ組恢復情況顯著(P<0.05)高于其他組，僅次于ⅲ組；脾臟臟器系數ⅱ組與γ組顯著高于其余各組(P<0.05),但彼此無顯著差異(P>0.05)，α組脾臟器系數顯著降低(P<0.05)且效果最優，表明15 kGy高劑量輻照紅參提取物能顯著緩解糖尿病小鼠脾充血腫大的狀態，其效果接近于特定劑量的鹽酸二甲雙胍；糖尿病造成腎負擔加重，表中顯示ⅱ組腎臟肥大臟器系數顯著高于其余各組(P<0.05)，經過不同劑量受試物干預后，α組和λ組腎臟臟器系數顯著改善(P<0.05)，表明高劑量的紅參皂苷提取物能顯著恢復腎臟狀態(P<0.05)。以上結果共同說明了高劑量15 kGy輻照紅參皂苷提取物能顯著改善心、肝、脾、腎的狀態(P<0.05)。由此可知，輻照紅參提取物可起到保護糖尿病小鼠臟器損傷的效果。

表6 紅參提取物對各組小鼠臟器系數的影響?

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

3 結論

試驗初期發現經過15 kGy60Co-γ射線輻照的紅參，其降血糖相關的人參皂苷Rh4及CK含量得到了顯著提升，而后續的動物試驗顯示經過15 kGy60Co-γ射線輻照的高劑量紅參皂苷提取物顯著恢復了1型糖尿病小鼠的體重增長，降低了其血糖水平和飲水量以及攝食量，提升了食物利用率(P<0.05)，減少了其尿量，同時顯著降低了HbAlc含量和血清TG和TC水平(P<0.05)，并顯著恢復了心、肝、脾、腎臟器系數(P<0.05)。高劑量輻照后紅參皂苷提取物在降低1型糖尿病小鼠血糖和緩解其并發癥方面有較為明顯的效果，對糖尿病有一定的輔助治療作用。

試驗僅研究了60Co-γ射線輻照紅參對小鼠血糖及基礎指標的影響，沒有深入研究其降血糖機理，以及輻照后紅參成分的變化，在后續的研究中將對糖尿病相關的蛋白進行測定，并研究輻照后紅參成分的具體變化。